Eine häufige ostasiatische Variante der Aldehyddehydrogenase 2*2 fördert ventrikuläre Arrhythmien mit chronischem Licht

Jun 21, 2023

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 610 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Chronischer starker Alkoholkonsum geht mit tödlichen Herzrhythmusstörungen einher. Ob ein häufiger ostasiatischer spezifischer Aldehyd-Dehydrogenase-Mangel (ALDH2*2) zur Arrhythmogenese beiträgt, die durch geringen Alkoholkonsum verursacht wird, bleibt unklar. Hier zeigen wir, dass 59 gewohnheitsmäßige Alkoholkonsumenten, die ALDH2 rs671 tragen, ein längeres QT-Intervall (korrigiert) und häufigere ventrikuläre Tachyarrhythmieereignisse aufweisen, verglichen mit 137 gewohnheitsmäßigen ALDH2-Wildtyp-(Wt)-Alkoholkonsumenten und 57 Alkohol-Nichtkonsumenten. Insbesondere beobachten wir eine QT-Verlängerung und ein höheres Risiko vorzeitiger ventrikulärer Kontraktionen bei menschlichen ALDH2-Varianten, die gewohnheitsmäßig leichten bis mäßigen Alkoholkonsum aufweisen. Wir rekapitulieren einen menschlichen elektrophysiologischen QT-Verlängerungsphänotyp unter Verwendung eines Maus-ALDH2*2-Knock-in-Modells (KI), das mit 4 % Ethanol behandelt wurde und eine deutlich verringerte Gesamtmenge an Connexin43 zeigt, wenn auch eine erhöhte Lateralisierung, begleitet von deutlich herunterreguliertem sarkolemmalen Nav1.5, Kv1.4 und Kv4.2-Expression im Vergleich zu EtOH-behandelten Wt-Mäusen. Ganzzell-Patch-Clamps zeigen eine ausgeprägtere Verlängerung des Aktionspotentials bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen. Durch programmierte elektrische Stimulation können Rotoren nur bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen provoziert werden, zusammen mit einer höheren Anzahl und Dauer ventrikulärer Arrhythmie-Episoden. Die vorliegende Forschung trägt dazu bei, Leitlinien für sicheren Alkoholkonsum für Bevölkerungsgruppen mit ALDH2-Mangel zu formulieren und neuartige Schutzmittel für diese Personen zu entwickeln.

Trotz der hohen Belastung durch Herz-Kreislauf-Erkrankungen und der nicht ausreichend berücksichtigten jährlichen Todesfälle bei starken Alkoholtrinkern und Alkoholikern1 bleibt die genaue sichere Dosis für den Alkoholkonsum unklar und variiert geografisch2,3. Der Zusammenhang zwischen Alkoholkonsum und kardiovaskulärer Mortalität scheint einer J-Kurve zu folgen3. Eine kürzlich durchgeführte groß angelegte multiethnische epidemiologische Studie zeigte, dass Alkoholkonsummengen, die zuvor als relativ harmlos galten, mit einem höheren Risiko eines frühen Todes verbunden waren4. Frühere experimentelle Daten und Simulationsmodelle haben alkoholbedingte arrhythmogene Wirkungen mit akuter Exposition gegenüber hohen Alkoholdosen (Blutalkoholkonzentration >20 mM) oder chronischem starkem Alkoholkonsum (≥6 Getränke/Tag) in Verbindung gebracht. Elektrophysiologische Instabilität, die durch Alkoholexposition unter den oben genannten Bedingungen hervorgerufen wird, ist Berichten zufolge mit einer dysregulierten Ionenkanalhomöostase, einem verlängerten Aktionspotential und wiedereintretender Erregung verbunden, was alles zu einer erhöhten Anfälligkeit für ventrikuläre Arrhythmien (VA) und plötzlichen Herztod führt5 ,6,7. Derzeit ist die genaue toxische Schwelle des chronischen Alkoholkonsums und ihr mechanistischer Zusammenhang mit der Entwicklung von VA, einer schwerwiegenden, aber seltenen lebensbedrohlichen Arrhythmie, die durch Alkoholkonsum ausgelöst wird, weiterhin Gegenstand von Kontroversen8,9.

Die mitochondriale Aldehyddehydrogenase (ALDH2) spielt eine entscheidende Rolle bei der Ethanolentgiftung und dem Kardioschutz vor Ischämie-Reperfusionsschäden10,11. Die ALDH2 rs671-Variante oder das ALDH2*2-Allel, das ein inaktives ALDH2-Enzym kodiert und die Gesichtsrötungsreaktion durch Alkohol verursacht, ist eines der häufigsten und ethnisch spezifischsten Enzyme beim Menschen und betrifft weltweit etwa 540 Millionen Ostasiaten12. Die ALDH2*2-Variante hat in letzter Zeit aufgrund ihrer erhöhten Anfälligkeit für die toxischen Wirkungen von Alkohol große Aufmerksamkeit erregt13,14. Eine aktuelle epidemiologische Analyse, die dosisabhängige kardiovaskuläre Komplikationen durch Alkoholkonsum untersuchte, deutete darauf hin, dass die Interpretation dieser Zusammenhänge möglicherweise verzerrt ist, da nicht genügend Informationen zum genetischen Hintergrund vorliegen15. Wir haben zuvor gezeigt, dass eine gestörte ventrikuläre elektrische Leitung und ein gestörter Wiedereintritt mutmaßliche proarrhythmische Mechanismen in Tiermodellen mit hoher Ethanolaufnahme sind16. Wir vermuteten, dass dysregulierte elektrophysiologische Merkmale und Wiedereintrittsmechanismen bei Menschen mit ALDH2-Mangel VA bei einer niedrigeren Alkoholdosis, wie z. B. <2 Standardgetränken/Tag oder mäßigem Alkoholkonsum, verursachen können. Wir führten mechanistische experimentelle Studien durch, um den Zusammenhang zwischen ALDH2-Mangel und VA bei chronischer geringer bis mäßiger Alkoholexposition mithilfe eines Maus-ALDH2*2-Knock-in-Modells (KI) zu untersuchen. Wir haben außerdem eine 5-jährige klinische Längsschnittstudie durchgeführt, um diesen Zusammenhang und das Risiko von Herzrhythmusstörungen bei einer Kohorte von 196 menschlichen Probanden zu untersuchen, die für leichten bis mäßigen Alkoholkonsum sowie den Genotyp ALDH2 rs671 bekannt sind.

Von den 196 Erwachsenen mit gewohnheitsmäßigem leichten bis mäßigen Alkoholkonsum (Median: 13,9 [7,6–29,3] g/Tag, 1,2 [0,6–2,4] Standardgetränke/Tag) trugen 59 (30,1 %) das Varianten-Allel ALDH2 rs671 ( [ALDH2 Vt]; G/A oder A/A), während 137 (69,9 %) ALDH2-Wildtyp waren ([ALDH2 Wt]; G/G, Tabelle 1). Von den 57 Alkohol-Nichtkonsumenten waren 28 (49,1 %) ALDH2 Vt und 29 (50,9 %) ALDH2 Wt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass bis zu 70 % der Studienteilnehmer, die als gewohnheitsmäßige Alkoholkonsumenten eingestuft wurden, ALDH2 Wt waren (X2 p = 0,008), wohingegen bei den Nichtkonsumenten von Alkohol die Verteilung von Wildtyp- und ALDH2-Varianten-Trägern ungefähr gleich war ( Tabelle 1; ergänzende Abbildung 1b), die auf der Grundlage von Taiwan-Biobank-Daten (https://taiwanview.twbiobank.org.tw) ungefähr der gleichen ALDH2-Genotypverteilung (51 % ALDH2-Gewicht) entsprach, die in der allgemeinen, gesunden taiwanesischen Bevölkerung gefunden wurde. Insgesamt handelte es sich bei den gewohnheitsmäßigen Alkoholkonsumenten unabhängig vom ALDH2-Genotyp eher um Männer, und in der ALDH2-Wt-Gruppe war die Prävalenz von Bluthochdruck höher. Gewohnheitsmäßige Alkoholkonsumenten (Alc+) zeigten im Vergleich zu ihren jeweiligen Alkohol-Nichtkonsumenten (Alc−) eine längere QRS-Dauer und QTc, unabhängig vom ALDH2-Genotyp (beide p < 0,05) (Tabelle 1 und Abb. 1a), während gewohnheitsmäßige Alkoholkonsumenten (Alc+) länger waren ), die ALDH2 Vt trugen, zeigten außerdem eine signifikant längere QTc im Vergleich zu ALDH2 Wt-Alkoholkonsumenten (Alc+) (Abb. 1a). Rückwärts-multivariate Regressionsmodelle zeigten, dass eine höhere Dosierung des Alkoholkonsums (angepasster Koeffizient: 4,52 [95 % KI: 3,14–5,91], pro 10 g+/Tag, p < 0,001), ALDH2 Vt (angepasster Koeffizient: 7,67 [95 % KI: 2,15–13,18], p = 0,003), weibliches Geschlecht, Bluthochdruck in der Vorgeschichte, koronare Herzkrankheit (KHK) und Diabetes waren unabhängig voneinander mit einer QTc-Verlängerung verbunden (Abb. 1b). Bemerkenswerterweise zeigten ALDH2-Vt-Personen bei höheren täglichen Alkoholdosen eine höhere dosisabhängige Steigung der QTc-Verlängerung (r = 0,58) im Vergleich zu ALDH2 Wt-Teilnehmern (r = 0,31) (angepasste Pinteraktion: 0,017) (Abb. 1c). ).

ALDH2-Vt-Alkoholkonsumenten zeigten ein signifikant längeres QT-Intervall (korrigiert auf das RR-Intervall als QTc) im Vergleich zu Alkohol-Nichtkonsumenten (Alc−) und ALDH2-Wt-Alkoholkonsumenten (430,1 vs. 422,4 vs. 415,6 ms bei Alc−, Alc+ ALDH2 Wt und Alc+ ALDH2). Vt bzw.) (a). Das Boxdiagramm stellt das 25. und 75. Prozent-Quartil dar, die Linie stellt den Median dar und die Whisker sind 10 % (unten) und 90 % (oben). * bedeutet p < 0,05 für Alc+ im Vergleich zu Alc− innerhalb jeder Genotypgruppe (entweder ALDH Wt oder ALDH Vt). Schrittweise rückwärts gerichtete multivariate Regressionsmodelle, die die Zusammenhänge zwischen klinischen Kovariaten und dem QTc-Intervall in der aktuellen Studie untersuchen (b). Höhere tägliche Alkoholkonsummengen waren mit steileren QTc-Anstiegen bei Probanden mit ALDH2 Vt (rosa) im Vergleich zu ALDH2 Wt (blau) verbunden (bereinigte Interaktion: 0,017) (c). Die Balken in c stellen die Standardabweichung für QTc bzw. den Standardfehler für die Alkoholdosis dar. Die schattierten Bereiche repräsentieren den Bereich des 95 %-Konfidenzintervalls. *p < 0,05, **p < 0,001 für Alc+ gegenüber Alc− innerhalb jeder Genotypkategorie (entweder ALDH Wt oder ALDH Vt); #p < 0,05 für Alc+, ALDH Vt im Vergleich zu Alc+, ALDH Wt.

Serielle Folge-EKGs und eine symptomgesteuerte Holter-Studie wurden verwendet, um die klinische Häufigkeit und den Schweregrad von VAs bei unseren Studienteilnehmern zu bewerten. Während einer 5-jährigen Nachbeobachtungszeit wurden 17 Studienteilnehmer mit VAs (~7 %) identifiziert. Unter den Teilnehmern, die keinen Alkohol konsumierten, wurden keine gefunden, wohingegen 6 (4,4 %) bei gewohnheitsmäßigen ALDH2 Wt-Alkoholkonsumenten festgestellt wurden, wobei gewohnheitsmäßige Alkoholkonsumenten, die ALDH2 Vt in sich trugen, ein fast vierfach höheres Risiko für die Entwicklung signifikanter VAs aufwiesen (n = 11). , 18,6 %) (X2 p < 0,001). Es werden multivariate logistische Regressionsmodelle angezeigt, die zur Untersuchung der Prädiktoren von VAs verwendet werden (Tabelle 2). Abgesehen von einer bekannten CAD-Vorgeschichte hatten Personen, die ALDH2 Vt trugen, ein viermal höheres Risiko (bereinigtes Odds Ratio: 4,46, 95 %-KI: 1,50–13,23, ALDH2 Wt als Referenz), VA-Episoden zu entwickeln. Eine höhere Dosierung des Alkoholkonsums war unabhängig mit einem höheren Risiko für signifikante VAs verbunden (angepasstes Odds Ratio: 1,41, 95 %-KI: 1,13–1,74, pro 10 g/Tag-Inkrement; Tabelle 2), wobei das Risiko bei ALDH2 Vt stärker ausgeprägt war Träger (bereinigte Interaktion: 0,038); (Tabelle 2). Das Vorhandensein von ALDH2 Vt (rs671) hatte keinen Einfluss auf die CAD-Historie im Hinblick auf die VA-Entwicklung (angepasste Interaktion: 0,30). Bei Verwendung des Youden-Index zur optimalen Cut-Point-Schätzung betrug die tägliche Ethanolaufnahmeschwelle für signifikante VAs bei Studienteilnehmern mit ALDH2 Vt und ALDH2 Wt 9,6 g/Tag (0,7 Getränke/Tag) und 14,1 g/Tag (1,0 Getränk/Tag). ), jeweils.

Das Versuchsprotokoll ist dargestellt (Abb. 2a). Die Blutalkoholkonzentration (BAC) in Wildtyp- (Wt) und ALDH2 * 2 KI-Mäusen, denen 7 Wochen lang normale und 4% EtOH-Flüssignahrung verabreicht wurde, wurde bestimmt (ergänzende Abbildung 2). Sowohl Wt- als auch ALDH2*2-KI-Mäuse, die 7 Wochen lang mit einer 4%igen Alkoholdiät behandelt wurden, zeigten im Vergleich zu den Gruppen ohne Alkoholdiät einen leichten Anstieg der Bruttomorphologie der Herzwanddicke und der Herzgröße (Abb. 2b). Bei den mit 4 % EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen wurde im Vergleich zu den mit 4 % EtOH behandelten Wt-Mäusen und anderen Gruppen eine ausgedehntere interstitielle Myokardfibrose beobachtet (Abb. 2c, d). ALDH2*2 KI-Mäuse, denen 4 % EtOH verabreicht wurde, zeigten im Vergleich zu mit 4 % EtOH behandelten Wt-Mäusen und anderen Gruppen auch ein signifikant erhöhtes Verhältnis von Herzgewicht zu Körpergewicht (HW/BW) (Abb. 2d). Die BACs betrugen 0,011 ± 0,001 Vol.-% (2,120 ± 0,281 mM), 0,057 ± 0,007 Vol.-% (9,443 ± 1,102 mM), 0,013 ± 0,002 Vol.-% (2,098 ± 0,270 mM) und 0,068 ± 0,007 Vol.-% (11). .58 ± 1,171 mM ) für Mäusegruppen mit Wt/normaler Ernährung, Wt/4% EtOH-Ernährung, ALDH2*2 KI/normaler Ernährung bzw. ALDH2*2 KI/4% EtOH-Ernährung (ergänzende Abbildung 2). Bemerkenswerterweise replizierte der elektrokardiographische Phänotyp von mit 4 % EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen den menschlichen Phänotyp und zeigte eine deutliche Verlängerung der QT-Intervalle (QT und QTc) und einen spontanen Beginn von VAs im Vergleich zu den mit 4 % EtOH behandelten Wt-Mäusen und anderen Gruppen (2 von 7 Mäusen vs. keine in anderen Mäusegruppen, Abb. 2e–g, j). Ein ähnlicher Trend zu einer höheren QTc-Verlängerungssteigung bei mit 4 % EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu dem der mit 4 % EtOH behandelten Wt-Mäuse bei höheren BAC-Werten (Interaktion: 0,035) (Abb. 2k) wurde beobachtet.

Vier Monate alte homozygote ALDH2*2 KI-Mäuse (C57BL/6, männlich) nach 7 Wochen Behandlung mit 4 % Alc-Diät (a). Pathologiebezogene Befunde in repräsentativer Bruttomorphologie und Querschnitten von Mäuseherzen aus verschiedenen Gruppen, die eine erhaltene, aber etwas höhere Myokardmasse und LV-Wanddicke bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen zeigen (b). Histologische Analyse (H&E) mit Masson-Trichrom (MT)-Färbung von Herzschnitten (c). Das an das Körpergewicht der Mäuse gekoppelte Herzgewicht zeigte einen leichten, aber signifikanten Anstieg in den mit 4 % EtOH behandelten Mäusegruppen (links), insbesondere bei ALDH2*2 KI-Mäusen, im Vergleich zu denen ihrer jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung (d). Eine deutlich ausgedehnte Fibrose (schwarze Pfeile) im Myokard (hellblaue Färbung) wurde auch bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen beobachtet (rechts) (d). Abbildungen des Körperoberflächen-Elektrokardiogramms (EKG) im Mausmodell. Mit 4 % EtOH behandelte ALDH2*2 KI-Mäuse zeigten im Vergleich zu anderen Gruppen während 5 Minuten kontinuierlicher EKG-Aufzeichnung elektrokardiographische Phänotypen mit längerer QRS-Dauer, längerem QT-Intervall (e) und spontanem Auftreten häufiger VPCs (schwarzer Pfeil) (f). Im Durchschnitt zeigten QRS und QTc einen Anstieg von 16 % bzw. 23,6 % im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung bei EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen (beide p < 0,05) im Oberflächen-EKG (g–j). Es wurde eine höhere QTc-Verlängerungssteigung bei mit 4 % EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen (rosa) im Vergleich zu den mit 4 % EtOH behandelten Wt-Mäusen (blau) bei höheren BAC-Werten (Interaktion: 0,035) beobachtet (Abb. 2k). Die schattierten Bereiche repräsentieren den Bereich des 95 %-Konfidenzintervalls. Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für alle 4 % EtOH im Vergleich zur normalen Diätkontrolle innerhalb jeder Genotypgruppe (ALDH2*2 KI oder Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 für 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs. 4 % EtOH Gew.

Als nächstes untersuchten wir das Gap-Junction-Protein Cx43 und mehrere wichtige Ionenkanäle/Transporter, die an der ventrikulären Depolarisation/Repolarisation beteiligt sind. Eine doppelte Färbung von Myokardgewebe mit Cx43-Antikörper ergab, dass Cx43 bei mit 4 % EtOH behandelten Wt-Mäusen im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung hochreguliert war (Abb. 3a, b). Im Gegensatz dazu war Cx43 bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu den mit EtOH behandelten Wt-Mäusen deutlich herunterreguliert (36,6 % Reduktion, p = 0,006. Abbildung 3b). Die Cx43-Verteilung in den Kardiomyozyten beider mit EtOH behandelten Mäuse war verändert. Obwohl Cx43 bei Wt-Mäusen mit normaler Ernährung überwiegend auf die interkalierten Bandscheiben beschränkt war, wurde in beiden mit EtOH behandelten Mäusegruppen ein höherer Anteil an Cx43-Markierungen an den Seitenrändern der Kardiomyozyten beobachtet. Diese Ergebnisse deuten auf eine verstärkte Cx43-Lateralisierung sowohl in den mit EtOH behandelten Wt- als auch in den ALDH2*2 KI-Gruppen im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung hin, wobei mit EtOH behandelte ALDH2*2 KI-Mäuse im Vergleich zu denen der EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäuse eine ausgeprägtere Cx43-Lateralisierung zeigten. behandelte Wt-Mäuse (52,8 % bzw. 67,2 % Anstieg der mit EtOH behandelten Wt- und ALDH2*2-KI-Mäusegruppen im Vergleich zu normal gefütterten Wt-Mäusen, beide p < 0,001) (Abb. 3a, c).

Die immunkonfokale Mikroskopie zur myokardialen Doppelfärbung für WGA und Cx43 zeigte eine signifikant verringerte gesamte Cx43-Expressionsfläche (mit und ohne Korrektur der gesamten myokardialen Fläche) bei EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu EtOH-behandeltem Wt und normaler Ernährung ALDH2*2-KI-Mäusegruppen mit deutlicher Zunahme der zytoplasmatischen Cx43-Färbung (weiße Pfeile) (a, b). Im Vergleich zu den anderen beiden Kontrollgruppen mit normaler Ernährung (a, c) wurde in beiden mit EtOH behandelten Mäusegruppen ein deutlich erhöhtes Verhältnis der Cx43-Umverteilung an den seitlichen Kardiomyozytengrenzen beobachtet, wobei mit EtOH behandelte ALDH2*2-KI-Mäuse eine stärkere Ausprägung zeigten Anstieg der Cx43-Lateralisierung als mit EtOH behandelte Wt-Mäuse. Für jede Gruppe wurden 13–15 Bilder analysiert (3 Mäuse in jeder Gruppe) (×40, 800 Pixel). Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für alle 4 % EtOH im Vergleich zur normalen Diätkontrolle innerhalb jeder Genotypgruppe (ALDH2*2 KI oder Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 für 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs. 4 % EtOH Gew.

Die morphologische Analyse verschiedener Ionenkanalproteinexpressionen bei verschiedenen Mausgruppen mittels Immunfluoreszenzmikroskopie ist in der ergänzenden Abbildung 3 dargestellt. Ventrikuläre Kardiomyozyten wurden für Nav1.5 (grün), Cav1.2 (grün), Cav1.3 (grün) gefärbt. Kv1.4 (grün), Kv4.2 (grün), Kv4.3 (grün) und WGA (rot), zusammen mit DAPI-Färbung (blau). Kurz gesagt, die Immunfluoreszenzmikroskopie zeigte, dass die Kardiomyozyten beider mit EtOH behandelten Mäuse im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung morphologische Veränderungen und eine Umgestaltung der Ionenkanäle sowie abnormale architektonische Streifenmuster der Kardiomyozyten aufwiesen, die bei ALDH2 * 2 KI-Mäusen stärker ausgeprägt waren. Dazu können unorganisierte Färbung von Nav1.5 (weiße Pfeilspitze), abgeschwächte Färbung und Verlust der Streifenbildung von Kv1.4 (weiße Pfeilspitze und Sternchen markiert), unregelmäßige Aggregationen und abgeschwächte Färbung von Kv4.2 (weiße Pfeilspitze und Sternchen markiert) gehören, akzentuiert Färbung von Kv4.3 (weiße Pfeilspitze) und sowohl Cav1.2 als auch Cav1.3 akzentuiert, obwohl die Aggregation in Cav1.2 (weiße Pfeilspitze) verändert wurde.

Wir führten quantitative Western-Blot-Experimente durch, um die Proteinexpression zu quantifizieren (Abb. 4a – q). Western-Blotting von Gesamtgewebepräparaten zeigte hochreguliertes TGF-β1 und Kollagen-1 im Myokard sowohl von EtOH-behandelten Wt- als auch von ALDH2*2-KI-Mäusen. Auch hier wurden TGF-β1 und Kollagen-1 stärker in EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mausherzen exprimiert (Abb. 4b, c). Die Gesamtproteinexpression von Cx43 war in EtOH-behandeltem ALDH2*2 KI im Vergleich zu EtOH-behandelten Wt-Mäusen und anderen Gruppen signifikant herunterreguliert (alle p < 0,05) (Abb. 4d). Im Gegensatz dazu war die Cx43-Gesamtproteinexpression in mit EtOH behandelten Wt-Mäusen im Vergleich zu der in mit normaler Ernährung behandelten Wt-Mäusen hochreguliert. Die an der ventrikulären Depolarisation und Repolarisation beteiligten Ionenkanal-Expressionsniveaus spiegelten sich in der Gesamtexpression der Nav1.5-Expression wider, die sowohl bei EtOH-behandelten Wt- als auch bei ALDH2*2-KI-Mäusen im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung leicht hochreguliert war (S = 0,034 bzw. 0,028) (Abb. 4e). Sowohl Kv1.4 als auch Kv4.2 waren in EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu denen von ALDH2*2 KI-Kontrollmäusen mit normaler Ernährung (p = 0,029 bzw. 0,039) signifikant herunterreguliert, mit einer signifikant geringeren Kv4.2-Expression beobachtet bei EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu denen der EtOH-behandelten Wt-Mäuse. Diese Unterschiede waren bei mit EtOH behandelten Wt-Mäusen im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung nicht signifikant (p = 0,71 und 0,93) (Abb. 4f, g). Kv4.3 war bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu den mit EtOH behandelten Wt-Mäusen und anderen Gruppen erheblich hochreguliert (Abb. 4h). Cav1.3 vom L-Typ war bei mit EtOH behandelten Wt-Mäusen im Vergleich zur Wt-Mäusegruppe mit normaler Ernährung signifikant hochreguliert (p = 0,044), obwohl zwischen den Gruppen keine signifikanten Unterschiede für Cav1.2 festgestellt wurden (Abb. 4i, j). Sowohl der Natrium-Kalzium-Austauscher (NCX) als auch CaMKII (Gesamtexpression und ihre phosphorylierten/oxidierten Formen) waren in mit EtOH behandelten Proteinen im Vergleich zu denen ihrer jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung unabhängig vom Genotyp hochreguliert, wobei CaMKII das am deutlichsten hochregulierte Protein in EtOH war -behandelte ALDH2 * 2 KI-Mäuse (ergänzende Abbildung 4).

Densitometrische Analyse von Herzgewebe TGF-β1/Kollagen-1, Cx43 (Gesamtform) und einer Vielzahl von Ionenkanalproteinen (einschließlich Nav1.5, Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3, Cav1.2 und Cav1). .3) von vier Gruppen von Mäusen (a–q) mittels Western Blot. Im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung zeigten mit EtOH behandelte ALDH2*2 KI-Mäuse eine Reduzierung des Gesamt-Cx43 um 40,4 %, eine Reduzierung von Kv1.4 um 74,3 % und eine Reduzierung von Kv4.2 um 67,2 % (d, f, g). . Zytoplasmatische und membranöse Anteile der Ionenkanal-Expressionsniveaus (k–q) wurden getrennt untersucht, um die subzelluläre Verteilung ihrer Veränderungen bei deutlich ALDH2-funktionierenden Mäusen zu bestimmen, die mit normaler oder 4 % EtOH-Diät gefüttert wurden. Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für alle 4 % EtOH im Vergleich zur normalen Diätkontrolle innerhalb jeder Genotypgruppe (ALDH2*2 KI oder Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 für 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs. 4 % EtOH Gew.

Da die Membranfraktion von Ionenkanälen nach wie vor die grundlegende Funktionskomponente der Erzeugung elektrischer Impulse und Aktionspotentiale ist, haben wir die Expressionsniveaus des Myokardproteins der Membranfraktion getrennt von denen der Zytoplasmafraktion weiter untersucht (Abb. 4k – q). Wir beobachteten deutlich regulierte Nav1.5-Expressionen bei mit EtOH behandelten Mäusen. Sarcolemmal Nav1.5 war in EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu EtOH-behandelten Wt-Mäusen deutlich herunterreguliert (p < 0,001); Im Gegensatz dazu führte die EtOH-Behandlung bei Wt-Mäusen zu einem hochregulierten sarkolemmalen Nav1.5 im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung (p = 0,008) (Abb. 4l). Sowohl sarkolemmales Kv1.4 als auch Kv4.2 zeigten eine deutliche Herunterregulierung bei EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu denen ihrer jeweiligen EtOH-behandelten Wt-Mäusegruppen (jeweils p < 0,05) (Abb. 4m, n). Umgekehrt war membranöses Kv4.3 in EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu EtOH-behandelten Wt-Mäusen und anderen Gruppen deutlich hochreguliert (Abb. 4o). Die L-Typ-Kalziumkanäle von Cav1.2 und Cav1.3 in der membranösen Fraktion waren bei mit EtOH behandelten Wt-Mäusen im Vergleich zu ihren Wt-Kontrollmäusen mit normaler Ernährung signifikant hochreguliert, obwohl diese Unterschiede in ALDH2*2-KI-Mäusegruppen nicht beobachtet wurden. Schließlich wurden in beiden EtOH-behandelten Mäusegruppen im Vergleich zu ihren jeweiligen normalen Diätkontrollen unabhängig vom Genotyp signifikante Hochregulierungen von zytoplasmatischem Cav1.3, jedoch nicht von Cav1.2 beobachtet (Abb. 4p, q).

Dynamische Änderungen der Aktionspotentialdauer (APD) und der Leitungsgeschwindigkeit (CV) wurden analysiert, um die Auswirkungen von Alkohol auf die elektrischen Ausbreitungsmuster des Herzens von WT- und ALDH2*2-KI-Mäusen zu bewerten. Dargestellt ist das Membranpotential in der epikardialen Oberfläche des linken Ventrikels, das über eine optische Aufzeichnung bei einer Stimulationszykluslänge (PCL) von 300 ms ermittelt wurde (Abb. 5a). Die mittlere APD70 war bei mit EtOH behandelten Mäusen im Vergleich zu denen ihrer jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung unabhängig vom Genotyp durchweg länger, wobei bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen insgesamt ein signifikant höherer APD70 im Vergleich zu den mit EtOH behandelten Wt-Mäusen beobachtet wurde ( Abb. 5b). Bei einer PCL von 200 ms gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen den CVs der vier verschiedenen Gruppen. Trotz deutlich erhöhter CVs bei mit EtOH behandelten Mäusen im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung beobachteten wir, dass die CVs bei mit EtOH behandelten Mäusen im Vergleich zu denen von ALDH2*2 KI-Mäusen mit normaler Ernährung bei PCLs von 250 und 300 ms erheblich verringert waren. Mit EtOH behandelte ALDH2 * 2 KI-Mäuse zeigten bei PCLs von 250 und 300 ms außerdem signifikant niedrigere CVs im Vergleich zu denen der mit EtOH behandelten Wt-Mäuse (Abb. 5c, d). Diese Ergebnisse zeigten, dass mit EtOH behandelte ALDH2*2 KI-Mäuse eine signifikant verlängerte APD und niedrigere CVs bei höheren PCLs aufwiesen.

a Optisches Aktionspotential bei 300 ms PCL. b APD bei 70 % Repolarisation. c Ein Beispiel für die elektrische Ausbreitung als Isochronkarten im Ventrikel bei 300 ms PCL. d Lebenslauf an verschiedenen PCLs; n = 6 in jeder Gruppe; Fehlerbalken sind SD; p-Werte wurden mit GraphPad Prism 8.0 mit mehreren t-Tests berechnet. APD-Aktionspotentialdauer, CV-Leitungsgeschwindigkeit, PCL-Stimulationszykluslänge. e Gleichzeitige EKG-Aufzeichnungen und ventrikuläre optische Kartierung wurden während der VA-Induktion anhand eines Beispiels einer malignen VA in EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen durchgeführt. Mit EtOH behandelte Wt-Mäuse zeigten nur eine VA-Episode mit einem leichten Wellenbruch und zeigten während der VA keine Rotationen (ergänzende Abbildung 2, ergänzender Film 2). Wt- und ALDH2*2-KI-Mäuse, die mit normaler Ernährung gefüttert wurden, zeigten nach der PES-Induktion eine reibungslose elektrische Ausbreitung (Ergänzungsfilme 3 und 4). f Punkte mit dominanter Frequenz (DF) und Schnappschüsse der Spiralwelle, die dem optischen Signal im Zeitbereich an einem bestimmten Punkt während der VA entsprechen, wobei g mehrere VA-Schläge und Auslöseorte dargestellt sind (weiße Pfeile). h, i Quantifizierung der induzierten VA-Episoden und Dauer. (n = 6 in jeder Gruppe). Fehlerbalken stellen die Standardabweichung dar; p-Werte wurden über ungepaarte Student-t-Tests mit GraphPad Prism 8.0 berechnet. VA ventrikuläre Arrhythmie, PES programmierte elektrische Stimulation, DF dominante Frequenz.

Die Anfälligkeit von mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen für Arrhythmien wurde mittels programmierter Stimulation weiter getestet. Während der VA-Induktion wurde bei EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen nach PES eine hohe Anfälligkeit für maligne VAs zusammen mit induzierbarer hochfrequenter Re-Entrant-Aktivität beobachtet (11 Episoden/6 Mäuse in EtOH-behandeltem ALDH2*2 KI vs. 0–1). Episode/6 Mäuse in anderen Gruppen, alle p <0,05) (Abb. 5e – i; ergänzende Abb. 5, 6). Unter Verwendung einer dominanten Frequenzkarte wurden bei 4 von 6 mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen während VA-Schlägen hochfrequente Bereiche von VA-Rotationen und induzierbare mäandernde Rotoren mit mehreren desorganisierten Wavelets beobachtet, in anderen Gruppen jedoch nicht (Abb. 5f, g; Ergänzende Abbildungen 5, 6; Ergänzender Film 1). Im Vergleich dazu zeigte nur eine mit EtOH behandelte Wt-Maus abnormale Aktivierungswellenfronten mit induzierbaren VAs (ergänzende Abbildung 6b; ergänzender Film 2), und keine der Mäuse in der Wt-Gruppe mit normaler Ernährung oder der ALDH2 * 2 KI-Gruppe mit normaler Ernährung zeigte diese induzierbare VA (Ergänzende Abbildungen 6a, c; Ergänzende Filme 3, 4). Mit EtOH behandelte ALDH2*2-KI-Mäuse hatten eine signifikant höhere Anzahl und Dauer von VA-Episoden als die mit EtOH behandelten Wt-Mäuse (Abb. 5h, i). Diese Ergebnisse zeigten, dass erhöhte VA-Episoden sowie VA-Dauer die wichtigsten proarrhythmogenen Merkmale bei mit EtOH behandelten ALDH2*2-KI-Mäusen zusammenfassten.

Um festzustellen, ob die APD von mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen verändert ist, wurden isolierte Kardiomyozyten mithilfe der Patch-Clamp-Technik überwacht. Kardiomyozyten wurden im Current-Clamp-Modus mit 5 ms überschwelligen depolarisierenden Reizen stimuliert. APD (bei 50 % und 90 % Repolarisation) war in den Kardiomyozyten sowohl von EtOH-behandelten Wt- als auch von ALDH2*2 KI-Mäusen verlängert. Signifikant längere APDs wurden sowohl bei APD50 als auch bei APD90 in Kardiomyozyten aufgezeichnet, die aus EtOH-behandelten Mäusen isoliert wurden, im Vergleich zu denen ihrer jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung, unabhängig vom Genotyp, wobei die EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Kardiomyozyten signifikant längere APDs aufwiesen als die der EtOH-behandelten Wt-Mäuse (alle p <0,05) (Abb. 6a, b). Dies deutete darauf hin, dass die APD-Verlängerung auch unsere Erkenntnisse zum morphologischen optischen Mapping-Membranpotential untermauerte (Abb. 6a). Der Hauptdepolarisationsstrom beim AP-Aufwärtshub (Vmax) von Kardiomyozyten, der dysfunktionale Nav1.5, kann dazu beitragen, den Na+-Einstrom zu reduzieren, die Impulsausbreitung zu verlangsamen und die Heterogenität der Hafenleitung zu verringern17,18. In der vorliegenden Studie war Vmax in isolierten Kardiomyozyten beider mit EtOH behandelten Mäuse im Vergleich zu denen in ihrer jeweiligen normalen Diätkontrolle unabhängig vom Genotyp erheblich verringert (125,9 ± 6,3 vs. 146,9 ± 9,6 mV/s für Wt-Mäuse, p = 0,04). ; 97,6 ± 8,0 vs. 140,4 ± 13,9 mV/s für ALDH2*2 KI-Mäuse, p < 0,01), wobei die mit EtOH behandelten ALDH2*2-Kardiomyozyten außerdem einen deutlich niedrigeren Vmax aufwiesen als die mit EtOH behandelten Wt-Mäuse (p < 0,01, Abb. 6c). Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen dem Ruhemembranpotential und der Aktionspotentialamplitude isolierter Kardiomyozyten aller Gruppen (Abb. 6d).

Vergleiche überlagerter Aufzeichnungen von APD bei 50 % und 90 % Repolarisation (a, b), Vmax (c), Ruhemembranpotential (RMP) und Aktionspotentialamplitude (APA) d zwischen verschiedenen Mausgruppen. Vmax betrug 97,6 ± 8,0 gegenüber 140,4 ± 13,9 mV/s für mit EtOH behandelte bzw. normal ernährte ALDH2*2 KI-Mäuse; und 125,9 ± 6,3 vs. 146,9 ± 9,6 mV/s für mit EtOH behandelte bzw. normal gefütterte Wt-Mäuse. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für alle 4 % EtOH im Vergleich zur normalen Diätkontrolle innerhalb jeder Genotypgruppe (ALDH2*2 KI oder Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 für 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs. 4 % EtOH Gew. n = 8 unabhängige Zellen in jeder Gruppe. Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar.

Um die Mechanismen aufzuklären, die der Verringerung des Vmax-Aktionspotentials in mit Alkohol behandelten Maus-Kardiomyozyten mit oder ohne ALDH2-Mutation zugrunde liegen, verglichen wir den Natriumstrom (INa) der Kardiomyozyten zwischen verschiedenen Gruppen (Abb. 7a – d). INa wurde durch einen 50 ms langen Depolarisierungsschritt von –80 mV auf +30 mV mit einem Zuwachs von 5 mV ausgehend von einem Haltepotential von –80 mV hervorgerufen. Repräsentative Spuren und Strom-Spannungs-Beziehungen zeigten, dass INa in den Kardiomyozyten, die aus beiden mit EtOH behandelten Mäusegruppen isoliert wurden, deutlich verringert war, insbesondere in denen, die aus den mit EtOH behandelten Mäusen stammten, im Vergleich zu denen ihrer jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung (–54,28 ± 5,69). vs. –66,87 ± 8,09 pA/pF bei –45 mV für Wt-Mäuse, p < 0,05; –32,23 ± 4,42 vs. –66,50 ± 7,93 pA/pF bei –45 mV für ALDH2*2 KI-Mäuse, p < 0,001) (Abb . 7b–d). Die beeinflusste INa-Kinetik bei mit 4 % EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen wurde mithilfe einer INa-Inaktivierungskurve analysiert. Verschiedene Spannungspegel von Konditionierungsvorimpulsen (–120 bis 30 mV) wurden 200 ms lang angelegt, um die Kanalinaktivierung zu induzieren, um die Inaktivierung von spannungsabhängigem INa zu untersuchen. Anschließend wurde ein zweiter Impuls (–30 mV) verwendet, um das Membranpotential 50 ms lang zu depolarisieren (ergänzende Abbildung 7a). Die Amplitude von INa wurde dann auf die maximale Stromamplitude normiert (ergänzende Abbildung 7b) und die Spuren wurden unter Verwendung des Boltzmann-Gleichungsmodells angepasst (ergänzende Abbildung 7c). Die Ergebnisse zeigten, dass die INa-Inaktivierungskurve in den Kardiomyozyten von ALDH2*2 KI-Mäusen, die mit 4 % EtOH behandelt wurden, im Vergleich zu normal ernährten ALDH2*2 KI-Mäusen oder EtOH-behandelten Wt deutlich nach links verschoben war, mit einem steileren Anstieg und V0,5 beobachtet wurde Mäuse (beide p < 0,01), was auf unterschiedlich beeinflusste INa-Kinetiken hinweist. Mit EtOH behandelte Wt-Mäuse zeigten jedoch nur eine leichte, aber nicht signifikante Verschiebung der Inaktivierungskurve von Kardiomyozyten im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung (ergänzende Abbildung 7d). Andererseits wurde die Erholung von INa nach der Inaktivierung mithilfe eines typischen Protokolls mit paarigen Impulsen bestimmt. Nach einem Haltepotential von –80 mV wurden in jedem Intervall (0–380 ms) zwei identische Impulse von –30 mV für 30 ms getrennt (ergänzende Abbildung 7e). Ströme gegen Intervalle zwischen gepaarten Impulsen wurden erzeugt und aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 7f) und die Spuren wurden durch eine einzelne Exponentialgleichung angepasst (ergänzende Abbildung 7g).

INa und ICa wurden über einen 50 (a) bzw. 400 ms (e) Depolarisationsschritt hervorgerufen, wobei repräsentative Spuren (b, f für INa und ICa) und Strom-Spannungs-Beziehungen die INa- und ICa-Dichte (c, g) untereinander zeigten verschiedene Mausgruppen. Deutlich verringerte INa-Dichte von Kardiomyozyten in beiden EtOH-behandelten Mäusegruppen bei –45 mV (mit dem maximalen Strom) im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollpersonen mit normaler Ernährung, unabhängig von Genotypen und EtOH-behandelten Wt-Mäusen (d). Bei 0 mV waren die ICa-Dichten der Kardiomyozyten in beiden mit EtOH behandelten Mäusegruppen signifikant niedriger, insbesondere bei ALDH2*2 KI-Mäusen, im Vergleich zu denen in ihren jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung (h). Einzelheiten zu spannungsabhängigen INa/ICa-Inaktivierungskurven und zur Wiederherstellung von INa/ICa nach der Inaktivierung bei verschiedenen Mausgruppen sind in den ergänzenden Abbildungen ausführlicher beschrieben. 3 und 4. Der hervorgerufene gesamte nach außen gerichtete Kaliumstrom (IK) (i), repräsentative Spuren und Strom-Spannungs-Beziehungen, die die transiente nach außen gerichtete Kaliumstromdichte (Ito) bei verschiedenen Mäusegruppen zeigen. Der Ito wurde als Differenz zwischen dem Spitzenstrom (Ipeak) und dem Dauerstrom (Iss) (j) definiert. Die Ipeak-, Iss- und Ito(k)-Dichten waren in den Kardiomyozyten beider mit EtOH behandelten Mäusegruppen signifikant verringert. Sowohl die Ipeak- als auch die Ito-Dichte der Kardiomyozyten waren nur in den mit EtOH behandelten Zellen signifikant niedriger als in den jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung und dem ALDH2*2 KI-Genotyp. Diese Vergleiche waren in den Wt-Mäusegruppen (l) nicht signifikant. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 für alle 4 % EtOH im Vergleich zur normalen Diätkontrolle innerhalb jeder Genotypgruppe (ALDH2*2 KI oder Wt); #p < 0,05, ##p < 0,01, ###p < 0,001 für 4 % EtOH ALDH2*2 KI vs. 4 % EtOH Gew. n = 10 unabhängige Zellen in jeder Gruppe. Fehlerbalken stellen den Standardfehler dar.

Beide mit EtOH behandelten Gruppen zeigten eine signifikante Rechtsverschiebung mit einer erhöhten Zeitkonstante (τ) in den Erholungskurven nach der Inaktivierung im Vergleich zu denen ihrer jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung (p = 0,01 und p < 0,01 für Wt und ALDH2*2). KI-Mäusegruppen), was auf eine unterschiedlich veränderte AP-Kinetik hinweist (ergänzende Abbildung 7h). Insgesamt zeigten mit EtOH behandelte ALDH2 * 2 KI-Mäuse im Vergleich zu mit EtOH behandelten Wt-Mäusen eine signifikantere Verringerung des Kardiomyozyten-Natriumstroms (INa) und eine Verlängerung der Erholungszeitkonstante (τ) in den Erholungskurven nach der Inaktivierung (Abb. 7b – d; ergänzende Abb . 7). Wir untersuchten weiter die Rolle von Kalziumströmen (ICa) bei APD und verglichen den Kardiomyozyten-ICa verschiedener Mausgruppen (Abb. 7e – h). ICa wurde durch einen 400 ms langen Depolarisationsimpuls von –38 bis +60 mV mit einem Inkrement von 2 mV ab einem Haltepotential von –40 mV hervorgerufen. Die ICa-Dichte in den Kardiomyozyten beider mit EtOH behandelten Mäuse war im Vergleich zu der ihrer jeweiligen Kontrollgruppe mit normaler Ernährung verringert (–6,72 ± 1,28 gegenüber –8,48 ± 0,5 pA/pF bei 0 mV für Wt-Mäuse, p < 0,05; –4,41 ± 0,54). vs. –7,75 ± 0,55 pA/pF bei 0 mV für ALDH2*2 KI-Mäuse, p < 0,001) (Abb. 7f–h), wobei wiederum die aus den EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen isolierten Kardiomyozyten am stärksten auftraten deutliche Abnahme ihrer ICa-Dichte. Die Behandlung mit 4 % Alkohol verschob auch die zeitabhängige Erholungskurve nach rechts und verlangsamte die Erholung von ICa nach der Inaktivierung. Um die Inaktivierung von spannungsabhängigem ICa zu untersuchen, wurden 200 ms lang unterschiedliche Spannungsniveaus von Konditionierungsvorimpulsen (–40 bis 10 mV) angelegt, um die Kanalinaktivierung zu induzieren. Anschließend wurde 100 ms lang ein zweiter Impuls (0 mV) angelegt, um das Membranpotential zu depolarisieren (ergänzende Abbildung 8a). Die Amplitude von ICa wurde dann auf die maximale Stromamplitude normiert (ergänzende Abbildung 8b) und die Spuren wurden unter Verwendung des Boltzmann-Gleichungsmodells (ergänzende Abbildung 8c) angepasst. Es wurden keine signifikanten Veränderungen zwischen den ICa-Inaktivierungskurven der Kardiomyozyten aller Mäusegruppen beobachtet (ergänzende Abbildung 8d). Andererseits wurde die Wiederherstellung von ICa nach der Inaktivierung mithilfe eines typischen Protokolls mit paarigen Impulsen bestimmt. Nachdem ein Potential von –40 mV gehalten wurde, wurden zwei identische 200 ms lange 0 mV-Impulse mit Intervallen von 0–85 ms dazwischen angelegt (ergänzende Abbildung 8e). Ströme gegen Intervalle zwischen gepaarten Impulsen wurden aufgezeichnet (ergänzende Abbildung 8f) und die Spuren wurden über eine einzelne Exponentialgleichung angepasst (ergänzende Abbildung 8g). Die Zeitkonstante (τ) war in den Kardiomyozyten beider mit EtOH behandelten Mäuse im Vergleich zu der ihrer jeweiligen Kontrollgruppen mit normaler Ernährung unabhängig vom Genotyp signifikant erhöht (τ; beide p <0, 01; ergänzende Abbildung 8h), was darauf hinweist, dass ICa repolarisiert Die Kinetik wurde durch die Alkoholbehandlung erheblich gestört.

Um den Zusammenhang zwischen dem vorübergehenden Kaliumstrom nach außen (Ito) und der APD-Verlängerung in Kardiomyozyten von mit Alkohol behandelten Wt- und ALDH2*2-KI-Mäusen zu klären, verglichen wir den Ito von Kardiomyozyten aus verschiedenen Gruppen im Spannungsklemmenmodus (Abb. 7i– l). Der gesamte nach außen gerichtete Kaliumstrom (IK) wurde durch eine 5 ms lange Depolarisation auf –40 mV hervorgerufen, gefolgt von einem 400 ms langen Depolarisationsimpuls von –30 mV auf +80 mV, mit einem Zuwachs von 5 mV ab einem Haltepotential von –70 mV . Ito wurde als Differenz zwischen dem Spitzenstrom (Ipeak) und dem Dauerstrom (Iss) definiert (Abb. 7j). Die Strom-Spannungs-Beziehungen zeigten, dass Ipeak, Iss und Ito in den Kardiomyozyten sowohl von EtOH-behandelten Wt- als auch von ALDH2*2 KI-Mäusen im Vergleich zu Wt-Mäusen mit normaler Ernährung signifikant niedriger waren (Abb. 7k). Bei +80 mV waren sowohl die Ipeak- als auch die Ito-Dichte der Kardiomyozyten der mit EtOH behandelten Mäuse im Vergleich zu denen ihrer Kontrollgruppen mit normaler Ernährung des ALDH2*2 KI-Genotyps signifikant niedriger (23 % bzw. 32 % Reduktion), unterschieden sich jedoch nicht signifikant zwischen EtOH-behandelten und normal ernährten Mäusegruppen des Wt-Genotyps (Ipeak und Ito: 27,68 ± 3,18 vs. 35,87 ± 2,26 pA/pF und 10,77 ± 1,77 vs. 15,83 ± 1,33 pA/pF für EtOH-behandeltes KI vs. normales Diät-KI , beide p < 0,05; 31,79 ± 3,11 vs. 47,52 ± 7,25 pA/pF und 12,45 ± 1,81 vs. 17,87 ± 3,33 pA/pF für mit EtOH behandeltes Wt vs. normales Diät-Wt, p = 0,08 bzw. 0,15; Abb. 7l ). Die Iss-Dichte der Kardiomyozyten beider mit EtOH behandelten Mäuse war unabhängig vom Genotyp mit der ihrer jeweiligen normalen Diätkontrolle vergleichbar (Abb. 7l). Es wurde festgestellt, dass weder die Ito-Inaktivierung (ergänzende Abbildung 9a – d) noch die Wiederherstellung (ergänzende Abbildung 9e – h) von Ito der Kardiomyozyten zwischen verschiedenen Gruppen unterschiedlich waren. Der nach innen gerichtete Gleichrichter-Kaliumstrom (IK1) war in allen vier Gruppen vergleichbar, was die Feststellung stützt, dass RMP in allen Gruppen ähnlich war (ergänzende Abbildung 10). Zusammengenommen zeigten unsere optische Kartierung und Simulation, die menschliche VA nachahmt, sowie die Ergebnisse von Patch-Clamp-Messungen von Einzelzell-Aktionspotentialen, dass der ALDH2*2-KI-Genotyp die charakteristische Komponente war, die mit VA bei Menschen assoziiert ist, die sich mit Licht-zu-Strahlung beschäftigen. mäßiger Alkoholkonsum.

Es wurde vermutet, dass die Schwelle für die toxische Wirkung von Alkohol bei Menschen, die Träger der ALDH2*2-Variante sind, deutlich niedriger ist19. Eine Senkung der Sicherheitsschwelle von Alkohol hat Auswirkungen auf die Gesundheit und hat klinische Auswirkungen auf schätzungsweise 540 Millionen Menschen, die fast 35–45 % der ostasiatischen Weltbevölkerung ausmachen10,12,13,14. Hier berichten wir, dass die QTc-Dauer (ALDH2 rs671 G/A oder A/A) bei menschlichen Probanden, die leichten bis mäßigen Alkoholkonsumenten sind, signifikant verlängert war (mittlere Dosis: 12,7 [IQR: 6,3–32,8] g/Tag, oder mittleres Standardgetränk: 0,9 [IQR: 0,5–2,3] Getränke/Tag; 1 US-Standardgetränk = 14 g reiner Alkohol) mit ALDH2-Varianten-Genotypen, verglichen mit gewohnheitsmäßigen Alkoholkonsumenten, die den ALDH2-Wild-Genotyp tragen, und Alkohol-Nichtkonsumenten3, 4. Unter Verwendung von ALDH2*2 KI-Mäusen, denen 7 Wochen lang eine Diät mit 4 % Alkohol verabreicht wurde, rekapitulierten wir den menschlichen elektrokardiographischen Phänotyp der QT-Verlängerung mit VA-Anfälligkeit. Eine VA-Anfälligkeit wurde ausschließlich bei lebenden, mit Alkohol gefütterten ALDH2*2-KI-Mäusen beobachtet und löste in ex vivo durch programmierte elektrische Stimulation Langendorff-perfundierte Herzen aus mit Alkohol gefütterten ALDH2*2-KI-Mäusen aus. Die Induktion von VA bei ALDH2*2 KI-Mäusen, denen eine niedrige Alkoholdosis verabreicht wurde, schien von einer pathologisch ausgelösten myokardialen Kollagenablagerung zusammen mit einer ausgeprägten Cx43- und sarkolemmalen Nav1.5-Remodellierung abzuhängen, die die Depolarisation beeinflusst. Beeinträchtigte repolarisierende Ionenmechanismen (z. B. Reduzierung der Ito-Dichte), die bei Einzelzell-Patch-Clamp-Kardiomyozyten beobachtet wurden, und abnormale CaMKII-Signalisierung verschlimmerten die verlängerte APD mit erhöhter VA-Anfälligkeit bei mit Alkohol gefütterten ALDH2*2-KI-Mäusen weiter.

Akute und starke Alkoholexposition löst nachweislich mehrere pathologische Signalkaskaden aus, die zu Arrhythmien führen5,20,21. Obwohl nachweislich chronisch starker Alkoholkonsum lebensbedrohliche Arrhythmien verursacht, bleibt unklar, ob ein ALDH2-Enzymmangel zu ungünstigen elektrophysiologischen Merkmalen bei einer niedrigeren sicheren Schwelle im Vergleich zu Personen ohne ALDH2-Mangel beiträgt. Basierend auf einem 5-jährigen Beobachtungszeitraum, der im Rahmen der vorliegenden Studie durchgeführt wurde, stellten wir fest, dass der Schwellenwert, der die tägliche Ethanolexposition mit dem Risiko der Entwicklung klinischer VAs verbindet, unter 1,0 Standardgetränken pro Tag (9,6 g/Tag oder 0,7) lag Getränke/Tag) für Menschen, die ALDH2-Varianten tragen, im Vergleich zu normalen ALDH2-Menschen (14,1 g/Tag oder 1 Getränk/Tag). Dieser Befund legt nahe, dass inaktive Träger des ALDH2-Enzyms, die leichte bis mäßige Mengen alkoholischer Getränke konsumieren, potenziell lebensbedrohlichen VA-Ereignissen ausgesetzt sein können. Darüber hinaus hatten Personen, die die inaktive Form von ALDH2 trugen, aufgrund der VA-Anfälligkeit eher extrem ungünstige Ergebnisse. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen zeigte die aktuelle Studie, dass VA-Episoden mit hohem Risiko zusammen mit der Bildung von Rotoren durch optische Kartierung (Abb. 5h, i) nur bei ALDH2 * 2 KI-Mäusen induzierbar waren, die mit einer Diät behandelt wurden, die 4 % EtOH, eine Dosis, enthielt Dies ist etwas niedriger als bei einer Diät, die die akzeptierte moderate Alkoholdosis von 5 % EtOH enthält, wie aus einer anderen Studie hervorgeht22. Im Vergleich zu Wt-Mäusen, denen 14 Wochen lang kontinuierlich eine Diät mit 6 % EtOH verabreicht wurde, was in einer früheren Studie von uns deutliche elektrophysiologische Störungen zeigte, zeigten Wt-Mäuse, denen 14 Wochen lang kontinuierlich eine Diät mit 4 % EtOH verabreicht wurde, nur mäßige ventrikuläre elektrophysiologische Effekte ohne provokantes VA16. Bemerkenswerterweise entsprach der BAC von 40–50 mg/dl (8–12 mM) in unseren mit 4 % EtOH behandelten Wt-Mäusen der bescheidenen Dosis beim Menschen23 und der leichten bis mäßigen Alkoholexposition in experimentellen Maus-C57BL/6-Modellen24. Diese Alkoholkonzentration wurde auch im Hinblick auf alkoholbedingte zentralnervöse Wirkungen als niedrige Dosis (2–20 mM) angesehen23. In einer anderen Studie wurde der akute Effekt der APD-Verlängerung in menschlichen ventrikulären Kardiomyozyten unter Verwendung eines Simulationsmodells nur bei einer hohen Ethanolkonzentration von 80 mM25 beobachtet, wohingegen eine APD-Verlängerung in ALDH2*2-abgeleiteten Maus-Kardiomyozyten bei einem niedrigeren Schwellenwert von 12 mM beobachtet wurde Ethanol.

Die Ergebnisse der aktuellen Studie zeigten, dass Cx43 in mit 4 % EtOH behandelten Wt-Mäusen sieben Wochen lang hochreguliert war. Wir beobachteten jedoch, dass Cx43 bei Wt-Mäusen mit 4 % EtOH-Behandlung über einen Zeitraum von 14 Wochen in unserer vorherigen Arbeit16 und bei mit 4 % EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen über nur 7 Wochen in der vorliegenden Studie signifikant herunterreguliert wurde, was möglicherweise darauf hindeutet Ein ALDH2-Mangel würde die Cx43-Anomalie bei gleicher Ethanoldosis beschleunigen. Wie in einer früheren Studie von uns berichtet, war Cx43 bei Wildtyp-C57BL/6-J-Mäusen, denen 36 % Alkohol als einzige Trinkflüssigkeitsquelle verabreicht wurde, hochreguliert26. Dennoch zeigten sowohl EtOH-behandelte Wt- als auch ALDH2*2-KI-Mausgruppen eine verstärkte Cx43-Lateralisierung (Abb. 3c), was wahrscheinlich die Bildung von nicht-junktionalen Halbkanälen förderte und den Stromaustritt mit verbesserter Ca2+-Dynamik erleichterte 27, 28. Diese arrhythmogenen Cx43-Remodellierungsmerkmale führten in Kombination mit einer interstitiellen Fibrose zu einer weiteren Beeinträchtigung der Zell-Zell-Kopplung und trugen teilweise zur verteilten Impulsausbreitung bei, was zu einem verlangsamten CV führte und den Wiedereintritt mit proarrhythmischen Effekten förderte17,29,30. Eine geringfügige Cx43-Remodellierung in Verbindung mit Faktoren, die die elektrische Leitung beeinflussen (z. B. verringerte Vmax), kann ebenfalls arrhythmogen sein. Darüber hinaus kann eine Herunterregulierung von Nav1.5 (oder INa) mit einer langsameren Phase 0 ebenfalls zur APD-Verlängerung beitragen17,18. Daher untersuchten wir INa weiter in EtOH-behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen unter Verwendung isolierter Einzelzell-Kardiomyozyten-Patch-Clamping29. Eine frühere Studie von uns hat gezeigt, dass die Verabreichung von 4 % EtOH über 14 Wochen bei C57BL/6 WT-Mäusen mäßige Auswirkungen hatte, wie z. B. eine Reduzierung des sarkolemmalen Nav1.5 (~30 %) und eine Dysfunktion16. Im Vergleich dazu war die Reduktion von membranösem Nav1.5 und INa bei ALDH2*2 KI-Mäusen ausgeprägter als bei mit EtOH behandelten Wt-Mäusen, die 7 Wochen lang mit 4 % EtOH behandelt wurden, obwohl dies sowohl bei EtOH-behandelten Wt- als auch bei ALDH2*2 KI-Mäusen auftrat verringerte Vmax und einen beeinträchtigten Na+-Einstrom mit gemeinsamen abnormalen Gating-Eigenschaften im Vergleich zu ihren jeweiligen Kontrollpersonen mit normaler Ernährung in unserer Patch-Clamp-Studie. Da außerdem sowohl das Ruhemembranpotential als auch IK1 Vmax und INa beeinflussen können, deuteten vergleichbare Werte dieser Tests (Abb. 6d und ergänzende Abb. 10) darauf hin, dass die beobachtete Verringerung von Vmax und die verminderte INa möglicherweise auf eine übermäßige Herunterregulierung von Nav1 zurückzuführen sind. 5 (wie bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen beobachtet) oder auf eine innere Nav1.5-Dysfunktion zurückzuführen. Insgesamt deuten diese Ergebnisse auch darauf hin, dass fehlreguliertes Cx43 und Nav1.5 bei mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen zu einem stärkeren Verlust der Leitungsreserve während der Depolarisation führten und dadurch elektrophysiologische Substrate bereitstellten, die die Einleitung der Bildung wiedereintretender Schaltkreise und der VA begünstigten Episoden.

Kv-Ionenkanalproteine, insbesondere Ito, könnten eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung der Kardiomyozyten-APD spielen, da der nach innen gerichtete Gleichrichter-Kaliumstrom (IK1) in unserer Studie zwischen verschiedenen Mausgruppen vergleichbar war29,31. Bemerkenswerterweise spielen sowohl Kv1.4 als auch Kv4.2 eine wesentliche Rolle als Ionenkanäle, die für die ventrikuläre Repolarisation bei Mäusen verantwortlich sind, wobei Kv4.2 als dominantes ventrikuläres Kv-Ionenkanalprotein fungiert32,33,34. Daher führte die herunterregulierte Kv4.2-Expression weiter zu einem Rückgang von Ito,f und einer Verlängerung von APD35. In der vorliegenden Studie waren beide sarkolemmalen Kv1.4/Kv4.2-Werte in EtOH-behandelten ALDH2*2-KI-Mäusen im Vergleich zu denen ihrer jeweiligen EtOH-behandelten Wt-Mäuse deutlich reduziert, was auf eine kritische Dysfunktion in Ito und Repolarisationsprozesse von ALDH2 hinweist Enzymmangel, der EtOH ausgesetzt ist und die Bildung von Arrhythmiesubstraten erleichtern kann. Im Gegensatz dazu schien Kv4.3, ein geringfügig funktionierender Ito,f-Kanal bei Mäusen, in unseren mit EtOH behandelten ALDH2*2 KI-Mäusen deutlich reguliert worden zu sein, um das unterdrückte Kv4.2 oder das verminderte Ito zu kompensieren, wie in anderen Studien berichtet33 ,36. Es ist auch bekannt, dass hochreguliertes Kv4.3 den Folgen von durch elektrische Streuung verursachten tödlichen VAs durch hyperaktiviertes CaMKII und Downstream-Signalisierung entgegenwirkt, indem versucht wird, den ventrikulären elektrischen/strukturellen Umbau bei bestimmten pathologischen Herzerkrankungen umzukehren37,38,39. Dennoch aktiviert eine fehlerhafte Ca2+-Homöostase aufgrund einer CaMKII-Überexpression, die durch die Alkoholbehandlung in ALDH2*2 KI-Mäusen verursacht wird, wahrscheinlich CaMKII-abhängige Downstream-Signale (z. B. Aktivierung des Natrium-Kalzium-Austauschers)40, indem ein nach innen gerichteter, depolarisierender Strom erzeugt wird, der weiter zur AP-Verlängerung beiträgt41, 42. In Übereinstimmung mit früheren Erkenntnissen, die darauf hinweisen, dass angesammeltes Acetaldehyd ICa über mehrere Mechanismen hemmen kann, beispielsweise eine gestörte intrazelluläre Ca2+-Homöostase durch direkte Begünstigung des RyR2-vermittelten Ca2+-Lecks und der RyR2-Hemmung, gestörte Ca2+-Phosphorylierung oder SERCA-vermittelte Ca2+-Leckage CAMKII-Aktivierung, wodurch die Menge an Ca2+ begrenzt wird, die bei Stimulation aus dem sarkoplasmatischen Retikulum freigesetzt wird. Wir vermuten daher, dass solche Effekte auch unter ALDH2*2-KI-Bedingungen möglich und verstärkt sein könnten21,43,44,45. Die langsamere und nach rechts verschobene ICa-Aktivierungskurve (Abb. 7g) in Verbindung mit einer langsameren Erholungszeitkonstante (τ) nach der Inaktivierung (ergänzende Abb. 8) kann die Kardiomyozyten für eine AP-Verlängerung prädisponieren und dadurch die Neigung zu Arrhythmien erhöhen. Zusammengenommen wirken diese Merkmale wahrscheinlich gleichzeitig und synergistisch, um die Bildung repolarisierender arrhythmogener Substrate und Rotoren mit höherer VA-Anfälligkeit während der programmierten Stimulation in ALDH2*2-KI-Mäusen zu fördern, die mit 4 % EtOH46 behandelt wurden. Zukünftige Studien müssen zeigen, ob diese Mechanismen und elektrischen Störungen die Ursachen für die erhöhte Anfälligkeit von ALDH2*2-tragenden Menschen, die chronisch leichten bis mäßigen Alkoholkonsum haben, für Herzrhythmusstörungen sind.

Zusammenfassend schließen unsere Ergebnisse die aktuelle Wissenslücke in Bezug auf die Alkoholsicherheitsschwellen ab, die erforderlich sind, um VAs bei menschlichen Probanden zu verhindern, die Wt ALDH2 tragen, und solchen, die die häufige inaktive Variante ALDH2*2 mit Alkoholintoleranz tragen. Nach unserem besten Wissen ist dies auch die erste Studie, die umfassende Daten zu den ventrikulären elektrophysiologischen Eigenschaften von Trägern der Varianten Wt ALDH2 und ALDH2*2 liefert, die chronisch leichtem bis mäßigem Alkoholgehalt ausgesetzt sind. Wir haben gezeigt, dass die mit VAs verbundene phänotypische APD-Verlängerung bei menschlichen Probanden, von denen bekannt ist, dass sie die ALDH2*2-Variante tragen, sowie leichter bis mäßiger Alkoholkonsum die Ergebnisse unserer Tierstudien mit ALDH2*2-KI-Mäusen, die mit einem entsprechenden niedrigen Alkoholkonsum behandelt wurden, vollständig untermauerte Dosis Alkohol. Mechanistische Studien haben mittels optischer Kartierung ventrikuläre Wiedereintrittssubstrate mit Rotorbildung gezeigt. Auf molekularer Ebene wurde festgestellt, dass eine Vielzahl von Ionenkanälen und die Umgestaltung von Connexin dysfunktionale Depolarisations-/Repolarisationsströme antreiben, was zu einer erhöhten Anfälligkeit für VAs führt (Abb. 8). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass der ALDH2*2-Genotyp die anfällige Komponente von VA bei Menschen mit leichtem bis mäßigem Alkoholkonsum ist und unterstreichen das Risiko tödlicher VAs, die durch geringen bis mäßigen Alkoholkonsum hervorgerufen werden. Bei der Interpretation aktueller Studienergebnisse ist Vorsicht geboten, da unser experimentelles Mäusemodell mit einer 4 %igen Alkoholdiät als einziger Nahrungsquelle behandelt wurde, die vom Muster und der Häufigkeit des Alkoholkonsums beim Menschen abweichen kann. Da ALDH2*2 eine große Weltbevölkerung betrifft, die aus 540 Millionen Ostasiaten besteht, von denen viele gewohnheitsmäßige leichte bis mäßige Alkoholtrinker sind, könnten unsere Ergebnisse in Zukunft eine Bestätigung durch weitere groß angelegte epidemiologische Studien erfordern. Andere asiatische ALDH2-Missense-Varianten als die ALDH2*2-Variante wurden kürzlich von der Human Genome Aggregation Database (gnomAD, https://gnomad.broadinstitute.org/)47 zusammengestellt. Mehrere dieser ALDH2-Varianten zeigten in vitro eine verringerte alkoholmetabolisierende Aktivität47. Es ist wahrscheinlich, dass Träger solcher ALDH2-Varianten in anderen ethnischen Gruppen durch den Konsum von leichtem bis mäßigem Alkohol ebenfalls anfällig für VA-Ereignisse werden. Ebenso haben unsere jüngsten Arbeiten gezeigt, dass ALDH2-Varianten bei leichtem bis mäßigem Alkoholkonsum anfällig für die Entwicklung von Vorhofflimmern und einer beeinträchtigten Vorhoffunktion sind48. Daher besteht ein wachsender Bedarf für politische Entscheidungsträger im Bereich der öffentlichen Gesundheit, Richtlinien für sicheren Alkoholkonsum für einen großen Teil der betroffenen Bevölkerung mit ALDH2-Mangel zu bewerten und zu formulieren. Es wurden niedermolekulare Enzymaktivatoren von ALDH2*2 wie Alda-1 entdeckt11. Aus präventiver Sicht können solche Verbindungen als Schutzmittel für Personen dienen, die Träger der ALDH2*2-Variante sind, häufig Alkohol konsumieren oder alkoholabhängig sind.

Veränderungen der elektrophysiologischen Eigenschaften des Herzens unter den Bedingungen (1) Wildtyp (Wt) ohne Verwendung von EtOH (linkes Feld), (2) Wt mit Verwendung von EtOH (mittleres Feld) und (3) ALDH2-Variante (Polymorphismus) mit Verwendung von EtOH ( rechtes Feld).

Wir haben prospektiv 268 Studienteilnehmer aus unseren Ambulanzen über einen strukturierten Fragebogen zum gewohnheitsmäßigen Alkoholkonsum rekrutiert. Die ALDH2-SNP-rs671-Genotypisierung wurde bei 260 Studienteilnehmern durchgeführt, von denen 256 nach Auswahl anhand von Ausschlusskriterien klinische demografische Informationen vervollständigten (ergänzende Abbildung 1a). Wir sammelten 12-Kanal-EKG-Ergebnisse der Körperoberfläche, anthropometrische Daten (wie Körpergröße, Gewicht und Taillenumfang), biochemische Informationen (einschließlich Lipidprofile und Nierenfunktion, definiert als eGFR unter Verwendung der MDRD-Formel) und medizinische Hintergrundgeschichten, einschließlich der Anwesenheit von Bluthochdruck, Typ-2-Diabetes, Hyperlipidämie-Behandlung, CAD und den damit verbundenen Medikamenten, die von allen Teilnehmern verwendet wurden. Alle unsere Studienteilnehmer waren frei von Herzinsuffizienz und hatten keine dringenden medizinischen Probleme. Von allen Studienteilnehmern wurde eine Einverständniserklärung eingeholt. Diese Teilnehmer wurden mindestens fünf Jahre lang hinsichtlich ihres Alkoholkonsums nachbeobachtet. Unsere Fragebögen und Umfragen ergaben, dass ihr Alkoholkonsummuster mindestens fünf Jahre lang stabil war. Die tägliche Alkoholaufnahmedosis wurde mithilfe eines strukturierten Fragebogens geschätzt, in dem verschiedene Arten konsumierter alkoholischer Getränke sowie Mengen und Häufigkeit des Konsums selbst angegeben wurden49. Kurz gesagt wurden die Studienteilnehmer gebeten anzugeben, wie oft sie Bier, Spirituosen, Wein und Starkwein konsumierten und wie viel sie bei jedem einzelnen Anlass konsumierten. Der wöchentliche Alkoholkonsum jedes Teilnehmers wurde in Gramm reinen Alkohols berechnet, indem das Produkt aus der Häufigkeit jedes konsumierten alkoholischen Getränks und der genauen Ethanoldosis (abgeleitet aus der Menge und der Ethanolkonzentration [d. h. 3,5–4,5 % für Bier]) multipliziert wurde. durch das spezifische Gewicht von Ethanol (0,79 g/ml) in jeder Art von alkoholischem Getränk) wie folgt:

Die Studienteilnehmer wurden in Alkohol-Nichtkonsumenten (definiert als diejenigen, die keine alkoholischen Getränke konsumierten oder die weniger als 14 g Alkohol (entspricht 1 Standardgetränk) pro Woche konsumierten) und gewohnheitsmäßige Alkoholkonsumenten (diejenigen, die mehr als 1 g Alkohol konsumierten) kategorisiert Standardgetränk/Woche). Um sich auf menschliche Probanden mit nur leichtem bis mäßigem Alkoholkonsum zu konzentrieren, wurden 3 der ursprünglich 256 Studienteilnehmer (die als starke Alkoholtrinker eingestuft wurden (Alkoholkonsum ≥ 90 g/Tag oder 6,4 Getränke/Tag) ausgeschlossen. Dies Dies führte zu einer Gesamtzahl von 253 Studienteilnehmern, darunter 196 gewohnheitsmäßige Konsumenten von leichtem bis mäßigem Alkoholkonsum, die in unsere endgültige Analyse und Nachverfolgung eingingen (Abb. S1A). Dabei handelte es sich um 196 gewohnheitsmäßige Konsumenten von leichtem bis mäßigem Alkoholkonsum und 57 Nichtkonsumenten von Alkohol wurden entsprechend ihrer ALDH2-Genotypen wie folgt weiter in zwei Gruppen eingeteilt: ALDH2*1-Wildtyp (Wt) und ALDH2-Variante (ALDH2 GA- oder AA-Genotyp) (ALDH2 Vt) (Tabelle 1). Diese Studie wurde vom Institutional Review Board bestanden des MacKay Memorial Hospital (14MMHIS069) und entsprach der Deklaration von Helsinki. Die während der aktuellen Studie generierten und/oder analysierten Datensätze sind auf begründete Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

Jeder Studienteilnehmer erhielt eine standardisierte 12-Kanal-EKG-Aufzeichnung der Körperoberfläche (Page Writer Trim III; Philips, Andover, MA, USA). Parameter in Bezug auf PR-Intervall, QRS-Dauer und QT-Intervalle (mit und ohne Korrektur des RR-Intervalls: QTc) wurden ermittelt und automatisch über Software analysiert, wobei die Papiergeschwindigkeit auf 50 mm/s eingestellt war, was einen präzisen und zuverlässigen QRSd- und QT-Index ermöglichte Maßnahmen.

Ausgangs- und Serien-EKGs wurden bis zu 5 Jahre lang jährlich durchgeführt oder zweimal pro Jahr in ambulanten Kliniken nachbeobachtet. Darüber hinaus wurde die Holter-Überwachung (für 24 Stunden kontinuierlich) auf der Grundlage der klinischen Beurteilung von Kardiologen und der klinischen Symptome (z. B. Herzklopfen, Schwindel oder Brustbeschwerden) oder Anzeichen (z. B. vermutete Arrhythmien) der Studienteilnehmer angeordnet. Klinische VAs wurden definiert als >1 vorzeitige ventrikuläre Kontraktion bei einer einzelnen 10-Sekunden-EKG-Aufzeichnung oder >30 vorzeitige ventrikuläre Kontraktionen pro Stunde (gemittelt durch 24-Stunden-Aufzeichnung) zu Studienbeginn oder während der Nachbeobachtung (bis zu 5 Jahre). wird Berichten zufolge mit einer höheren Rate an plötzlichem Herztod in Verbindung gebracht50.

Die ALDH2*2 KI-Tierstudie entsprach den institutionellen und nationalen Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren (Taiwan Animal Protection Law; Scientific Application of Animals, 1998). Alle in dieser Studie verwendeten Tiere (homozygote ALDH2*2-Mäuse und ihre Wildtyp-Wurfgeschwister) hatten einen genetischen C57BL/6-Hintergrund und die Protokolle wurden vom institutionellen Vorstand überprüft (MMH-AS-107-69). Vier Monate alte männliche Wildtyp-C57BL/6-Mäuse oder homozygote ALDH2*2-KI-Mäuse wurden in zwei Diätgruppen eingeteilt16. Dies waren (i) die Gruppe mit normaler Ernährung (flüssige Nahrung nach Belieben; Trockenmischung #F1259SP Bio-Serv® Advancing Science. Enriching Animals, USA-Test mit warmem Leitungswasser); und (ii) die 4 % EtOH-Gruppe (4 % v/v Alkohol-Flüssignahrung; Trockenmischung #F1697SP, Bio-Serv® ergänzt mit Maltose-Dextrin, Ethanol und warmem Leitungswasser). Flüssignahrung blieb sieben Wochen lang die einzige Flüssigkeits- und Nahrungsquelle, zu der die Mäuse Zugang hatten. Insgesamt bestand unser Studiendesign aus vier Mausgruppen: (i) Wt/normale Ernährung, (ii) Wt/4 % EtOH, (iii) ALDH2*2 KI/normale Ernährung und (iv) ALDH2*2 KI/4 % EtOH. In der Gruppe mit normaler Ernährung wurde Maltose-Dextrin isokalorisch durch Ethanol ersetzt. Eine Stunde nach der Fütterung wurden alle Mäuse unter tiefer Anästhesie eingeschläfert und venöses Blut aus dem Schwanz entnommen und gesammelt (0,1–0,2 ml). Serumproben wurden gesammelt und zentrifugiert und das Plasma bei –80 °C gelagert. Die BACs wurden mit einem EnzyChrom™ Ethanol Assay Kit (ECET-100, BioAssay Systems) bestimmt. Das Versuchsprotokoll wurde vom Animal Care and Use Committee des Institutional Review Board des MacKay Memorial Hospital genehmigt. Die Mäuse wurden durch Isofluran-Anästhesie mit transkardialer Perfusion mit Kochsalzlösung eingeschläfert. Eine schematische Darstellung der Mausstudie ist dargestellt (Abb. 1).

Das Körperoberflächen-EKG wurde unter Narkose mit 1–2 % Isofluran (FORANE, ABBOTT Laboratories Ltd., England) in einer Kombination aus Sauerstoff und Lachgas gemischt mit Luft im Verhältnis 50:50 durchgeführt. Nach der Stabilisierung wurden unsere Versuchsmäuse detaillierten EKG-Untersuchungen der Körperoberfläche (bei einer Herzfrequenz von ~450–550 Schlägen/min) mit Elektroden unterzogen, die an ein Biopac-Überwachungssystem (Biopac Systems, Inc., Goleta, CA, USA) angeschlossen waren. Das Körperoberflächen-EKG wurde mithilfe von EKG-Elektroden durchgeführt, die subkutan in alle vier Gliedmaßen eingeführt wurden, und sequenzielle EKG-Aufzeichnungen wurden 10 Minuten lang mit einer Abtastgeschwindigkeit von 2 kHz erfasst. EKG-Ergebnisse für Mäuse wurden als Rohdaten gespeichert und zu Beginn (16 Wochen alt) und am Studienendpunkt (23 Wochen alt) vor der Tötung aufgezeichnet. Die Daten wurden für die Offline-Analyse mithilfe von benutzerdefinierten 2 MATLAB-Skripten gespeichert, die mit kommerziell erhältlicher Software (Biopac Student Lab Analysis 4.1.0) analysiert wurden und 30–35 Herzschläge abdeckten. Das PR-Intervall wurde vom Beginn der P-Welle bis zum Höhepunkt der R-Welle gemessen. Das QRS-Intervall wurde vom Beginn der Q-Welle bis zu dem Punkt gemessen, an dem die S-Welle den Basispunkt kreuzte. Das QT-Intervall wurde vom Beginn der Q-Welle bis zu dem Punkt gemessen, an dem die T-Welle auf 90 % (T90) vom Höhepunkt abfiel. Adaptive herzfrequenzkorrigierte QT-Werte wurden mithilfe einer Modifikation der Mitchell-Formel für Maus-EKG wie folgt abgeleitet:

Um die Morphologie und Umbaumuster von myokardialem Cx43 zu analysieren, wurde immunmarkiertes Cx43 aus Myokardproben abgebildet und mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie unter Verwendung eines Leica TCS SP, ausgestattet mit einem Argon/Krypton-Laser, untersucht. Die morphologische und strukturelle Umgestaltung verschiedener Ionenkanalproteine, einschließlich Nav1.5, Kv1.4, Kv4.2, Kv4.3, Cav1.2 und Cav1.3, wurde mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. Mäuseherzen wurden zunächst mit normaler Kochsalzlösung perfundiert. Alle ventrikulären Proben wurden anschließend in OCT-Lösung eingebettet und bei –80 °C gelagert. Gefrorenes Gewebe wurde in 3 µm-Schnitte geschnitten und mit 4 % Paraformaldehyd fixiert, mit 0,5 % Triton gepufferte Kochsalzlösung) für eine Stunde. Zur Erkennung von Herzumgestaltungen wurde auch eine Doppelfärbung von Weizenkeimagglutinin und Connexin 43 durchgeführt. FITC-konjugiertes WGA (Vector, Burlingame, CA, USA) wurde zum Nachweis von Zellgrenzen verwendet. Zum Nachweis von Cx43 wurde ein Anti-Cx43-Antikörper (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) verwendet. Esel-Anti-Kaninchen-Cy3 (Chemicon, Kalifornien, USA) wurde verwendet, um immunmarkiertes Connexin43 (Cx43) sichtbar zu machen.

Für Ionenkanal- und WGA-Doppelmarkierung: Nav1.5 (1:200, polyklonales Kaninchen, Alomone Labs), Cav1.2 (1:100, polyklonales Kaninchen, Alomone Labs), Cav1.3 (1:100, polyklonales Kaninchen, Alomone Labs), Kv1.4 (1:100, Kaninchen-Polyklon, Alomone Labs), Kv4.2 (1:100, Kaninchen-Polyklon, Alomone Labs) und Kv4.3 (1:100, Kaninchen-Polyklon, Alomone Labs) Antikörper waren über Nacht bei 4 °C inkubiert, gefolgt von der Markierung mit Ziegen-Anti-Kaninchen Alexa 488 (1:400, Invitrogen). Und am nächsten Tag wurden WGA-Konjugate mit Alexa 594 (1:500, Invitrogen) 2 Stunden lang bei 25 °C inkubiert. Alle Abschnitte wurden mit einem DAPI-haltigen Anti-Fade-System montiert.

Die Bilder wurden mit einem 40-fachen Objektiv und einem Zoom von 1,0 für Cx4,3/WGA-Färbung aufgenommen; Zoom 4.0 für Ionenkanal-/WGA-Färbung der Computereinstellung. Jedes aufgenommene Bild bestand aus 1024 × 1024 Pixeln. Projektionsansichten von vier aufeinanderfolgenden optischen Schnitten wurden in Abständen von 0,25 oder 1 μm in der Mitte der Schnitte aufgenommen und zur Analyse aufgezeichnet. Alle Bilder wurden mit der Software ImageJ oder Adobe Photoshop CS6 verarbeitet.

Die Bildanalyse von Cx43 wurde mit der QWIN-Bildanalysesoftware (Leica) zur Analyse der myokardialen Cx43-Verteilung durchgeführt und die folgenden Informationen und Bewertungen wurden von jeder Mausgruppe erhalten, einschließlich (i) der Gesamtfläche von immunmarkiertem Cx43 (pro Bildschnitt), ( ii) die Gesamtfläche von immunmarkiertem Cx43 pro Kardiomyozytenfläche und (iii) der Prozentsatz der immunmarkierten Cx43-Fläche entlang der Seitenränder dividiert durch die Gesamtfläche immunmarkierter Cx43-Proteine ​​in einzelnen Kardiomyozyten.

Western Blot von Gesamtgewebepräparaten aus Myokardgewebeproben für Cx43 (einschließlich der gesamten, phosphorylierten [funktionellen] [p-Cx43] und nicht phosphorylierten [np-Cx43] Isoformen von Cx43), Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II ( CaMKII (sowohl Gesamt- als auch oxidierte [ox-CaMKII]-Formen), Ionenkanäle und relevante Ionentransporterproteine, die für die Erzeugung des Aktionspotentials verantwortlich sind, wurden unter Verwendung geeigneter Antikörper durchgeführt. Zytoplasmatische und membranöse Fraktionen wichtiger Ionenkanäle oder Proteine, die mit elektrophysiologischen Eigenschaften verbunden sind, wurden weiter getestet. Gewebeproben der freien Wand des linken Ventrikels (als Gesamtgewebepräparate) aus flüssigem Stickstoff wurden unter Verwendung von 1 % NP40-Zelllysepuffer, der eine Phosphatase-Inhibitor-Cocktail-Tablette (Roche) und eine Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette (Roche) enthielt, lysiert und mittels Ultraschall homogenisiert . Zytoplasmatische und Membranproteine ​​der freien Wand des linken Ventrikels wurden unter Verwendung eines CNM-Kompartiment-Proteinextraktionskits (K3012010, BioChain, USA) hergestellt. Das Gesamtprotein wurde mithilfe der Lowry-Methode (DC Protein Assay Kit, Bio-Rad, USA) geschätzt.

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde unter Verwendung von Minigelen aus 5 % Stapelgelen und 10–12 % Trenngelen durchgeführt. Als nächstes wurden 30–40 µg jedes Gewebeproteins, 100 µg Zytoplasmafraktion oder 50 µg Membranfraktion mit Probenpuffer (2,5 % 2-Mercaptoethanol und 1 % Bromphenolblau) gemischt, um ein Endvolumen von 20–30 zu erzeugen µL, in jede Spur geladen, einer Elektrophorese unterzogen (80 V zum Laufen im Stapelgel und 120 V im Trenngel; konstante Spannung) und übertragen (80 V, konstante Spannung für 150 Minuten auf Eis). Die PVDF-Membran (Perkin Elmer, USA) wurde unter Verwendung von Primärantikörpern nachgewiesen, die spezifisch für Collagen-1 (1:1000, Maus-Monoklon, Sigma), Cx43 (1:250, Maus-Monoklon, BD Biosciences) und Cx43 (1:1000, Kaninchen-Polyklon) sind , Sigma-Aldrich) zur Erkennung der phosphorylierten (funktionellen) (p-Cx43) Form und der nicht phosphorylierten (np-Cx43 [Cx43-P0]) Isoformen von Cx43. TGF-beta 1 (1:500, Maus-Monoklon, Santa Cruz), Nav1.5 (1:200, polyklonaler Kaninchen-Klon, Alomone Labs), Kv1.4 (1:200, polyklonaler Kaninchen-Klon, Alomone Labs), Kv4. 2 (1:200, Kaninchen-Polyklon, Alomone Labs), Kv4.3 (1:200, Kaninchen-Polyklon, Alomone Labs), Cav1.2 (1:250, Kaninchen-Polyklon, Alomone Labs), Cav1.3 (1:250 , Maus-Monoklon, Gene Tex), NCX1 (1:1000, Maus-Monoklon, Gene Tex), p (Thr286)- Calcium/Calmodulin-abhängige Proteinkinase II (CaMKII) (1:2000, Maus-Monoklon, Gene Tex), ox -CaMKII (1:1000, polyklonaler Kaninchenklon, Gene Tex) und Gesamt-CaMKII (1:1000, polyklonaler Kaninchenklon, Gene Tex) bei 4 °C über Nacht. Die Blots wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur weiter mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die Immunreaktivität wurde mithilfe einer ECL-Lösung (Perkin Elmer, USA) zur Entwicklung der Bilder sichtbar gemacht. Um die Expressionsniveaus zu normalisieren, wurden die Blots entfernt und mit Anti-GAPDH-Antikörper (1:50.000, monoklonal Maus, Sigma-Aldrich) inkubiert, der als interne Kontrolle verwendet wurde. Um die Expressionsniveaus von Membranproteinen zu normalisieren, verwendeten wir das Membranmarkerprotein Na+ K+- ATPase (1:1000, polyklonal vom Kaninchen, Zellsignalisierung) als interne Kontrolle. Für das Western-Blotting wurden quantitative densitometrische Scans und Analysen der Blots durchgeführt, wobei das MultiGel-21-Bildsystem (TOPBIO CO. Taiwan) zur Bildentwicklung und die Gel-Pro-Software zur Analyse verwendet wurden. Unbeschnittene Originalversionen dieser Analyse waren in den ergänzenden Abbildungen verfügbar. 11–15.

Die Mäuse wurden unter Narkose eingeschläfert, um die VA ex vivo zu kartieren. Die Herzen wurden sofort mittels Thorakotomie entfernt und mit warmer sauerstoffhaltiger Tyrode-Lösung (pH 7,4; 95 % O2, 5 % CO2, 36–38 °C) Langendorff-perfundiert. Eine Ag/AgCl-Elektrode wurde am linken Ventrikel in der Nähe des Apex angebracht, während eine andere an der Oberfläche des rechten Ventrikels befestigt wurde, um das EKG aufzuzeichnen. Das isolierte Mäuseherz wurde mit einem spannungsempfindlichen Farbstoff (Di-4-ANEPPS, 100 μmol/L, ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) angefärbt, um optische Membranpotentiale nach 10 Minuten Stabilisierung aufzuzeichnen. Blebbistatin (5–10 μmol, TOCRIS, Bristol, UK) wurde direkt zu Tyrodes Lösung hinzugefügt, um Bewegungsartefakte zu reduzieren. Die Herzen wurden gleichmäßig mit einer grünen Leuchtdiode bei einer Wellenlänge von 505 ± 20 nm beleuchtet, um Di-4-ANEPPS zu aktivieren. Fluoreszenzbilder wurden durch einen 600-nm-Langpassfilter mit einer CMOS-Kamera (1000 Bilder/Sekunde, SciMedia, USA) aufgenommen. Die Anfälligkeit für stimulationsinduzierte VA wurde durch programmierte elektrische Stimulation über zehn Zyklen Burst-Stimulation (20 Hz, 10 s) beurteilt, was bei jeder Maus dem Doppelten der Erregungsschwelle des linken Ventrikels entsprach. Die vorherrschende Frequenz optischer Signale während der induzierten VA an jedem Ort des kartierten Bereichs wurde aufgezeichnet und unter Verwendung einer schnellen Fourier-Transformation berechnet. Unter Verwendung der Dominanzfrequenz aller Pixel wurde eine Dominanzfrequenzkarte erstellt.

Die Ganzzell-Patch-Clamp-Technik wurde verwendet, um Membranpotential und Ionenströme mit einem Axon CNS 700 B-Verstärker (Molecular Devices, CA, USA), einem Digidata 1550 A-Datenerfassungssystem und der pClamp-Software (Version 10, Molecular Devices) aufzuzeichnen Strom- und Spannungsklemmenmodi. Linksventrikuläre Myozyten wurden mithilfe der Langendorff-Herzperfusionstechnik enzymatisch isoliert. Mäuseherzen wurden retrograd mit Krebs-Puffer (120 mM NaCl, 12 mM Glucose, 25 NaHCO3, 1,2 KH2PO4, 1,2 MgSO4 und 5,4 KCl) perfundiert. Nach der Äquilibrierung wurden 0,4 mg/ml Kollagenase (Typ II, Worthington) in Krebs-Puffer perfundiert 20 Min. Mäuseherzen wurden in kleine Stücke geschnitten und in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (Invitrogen, Gibco) filtriert.

Ruhende Zellen wurden in einer auf dem Tisch eines Umkehrmikroskops (Eclipse Ti-U, Nikon Corporation, Japan) montierten Kammer in einer Badlösung mit 137, 5,4, 1,8, 1,1, 6, 22 und 0,33 mM NaCl, KCl platziert , CaCl2, MgCl2, HEPES, Glucose bzw. NaH2PO4. Der pH-Wert wurde mit NaOH auf 7,4 eingestellt. Für Experimente zum Nachweis von INa wurde N-Methyl-D-glucamin (91 mM) anstelle gleicher NaCl-Konzentrationen verwendet. In spezifischen Experimenten wurden Cs+ (2 mM) und Co2+ (1 mM) hinzugefügt, um Kalium- bzw. Kalziumströme zu blockieren. Hitzepolierte Glaselektroden (Spitzenwiderstände von ca. 2 MΩ beim Befüllen mit einer Innenlösung durch eine Pipette) wurden aus Borosilikatglaskapillaren (Außendurchmesser 1,5 mm) unter Verwendung eines Glas-Mikroelektrodenziehers (PC-10, Narishige International Inc., East) hergestellt Meadow, NY, USA). Die interne Lösung enthielt 120 mM KCl, 5 mM MgCl2, 5 mM MgATP, 10 mM HEPES und 15 mM EGTA; Der pH-Wert wurde mit KOH bei Raumtemperatur auf 7,2 eingestellt. Für die INa- und ICa-Messungen wurden der Pipettenlösung Cs+ und Tetraethylammonium (TEA) zugesetzt.

TaqMan SNP-Genotypisierungstests (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) wurden verwendet, um die ALDH2-Genotypisierung aller menschlichen Teilnehmer durchzuführen, während die direkte PCR-DNA-Sequenzierung zur Bestimmung der Genotypen unserer Versuchsmäuse in unserer Studie verwendet wurde. In menschlichen Genotypen wurden sowohl der ALDH2 rs671 GA- als auch der AA-Genotyp als Träger der ALDH2-Variante (ALDH2 Vt) definiert. Das Fehlen des ALDH2-rs671-Variante-A-Allels oder des GG-Genotyps wurde als ALDH2-Wildtyp-Träger (ALDH2 Wt) definiert. Genomische DNA wurde aus EDTA-haltigen Vollblutproben jedes Teilnehmers mithilfe eines halbautomatischen Extraktionssystems (Smart LabAssist, Taiwan Advanced Nanotech Inc., Tau-Yuan County, Taiwan) extrahiert, das mit einer TANBead-Blut-DNA-Platte (Taiwan Advanced Nanotech) ausgestattet war Inc.). Die DNA-Proben wurden dann mithilfe eines etablierten kommerziellen Dienstes (Genomics BioSci & Tech. Co., Ltd, Taiwan) auf den Zielpolymorphismus ALDH2 Glu487Lys (rs671, G/A) jedes Kandidatengens genotypisiert. Die bezeichneten SNPs wurden mittels Echtzeit-PCR-basierter Alleldiskriminierung unter Verwendung von Reagenzien für TaqMan SNP-Genotypisierungstests (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers bestimmt. In der aktuellen Studie wurden TaqMan-Sonden zur Untersuchung von ALDH2 Glu487Lys (rs671, G/A) verwendet. PCR-Amplifikation und Alleldiskriminierung wurden mit einem ViiA7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems) durchgeführt. Die quantitative PCR-Einstellung wurde bei 60 °C für 30 Sekunden programmiert, mit anfänglicher Denaturierung für 10 Minuten bei 95 °C, gefolgt von 40 Denaturierungszyklen bei 95 °C für weitere 15 Sekunden und Annealing bei 60 °C für 1 Minute. Der Allelnachweis und die Allelunterscheidung wurden 1 Minute lang bei 60 °C durchgeführt. Anschließend wurden die Rohdaten mit der ViiA7-Software (v1.2.4) analysiert. Die Erfolgsrate der Genotypisierung für die Analyse des Ziel-SNP (ALDH2 Glu487Lys [rs671, G/A]) betrug >96,6 % mit einer Fehlpaarungsrate von 0,0 %. Für die Genotypisierung von ALDH2 bei Mäusen wurde Maus-DNA aus Mäuseschwanzproben mit einem KAPA Mouse Genotyping Kit (KAPA Biosystems) extrahiert. Die Schwanzspitze, die nicht länger als 1–2 mm war, wurde in einem 100-μl-Volumen mit 88 μl PCR-Wasser, 2 μl 10X KAPA Express Extract-Puffer und 2 μl KAPA Express Extract Enzyme bei 75 °C für 10 Minuten verdaut, gefolgt von 95 °C für 5 Minuten, um das Enzym zu inaktivieren. Die PCR wurde mit 1 μl DNA in 1× KAPA2G Fast Genotyping Mix und 0,5 μM Primern durchgeführt: 5 min Denaturierung bei 95 °C, 35 Zyklen (20 s bei 95 °C, 20 s bei 60 °C, 30 s bei 72 °C). ) und abschließende Verlängerung bei 72 °C für 5 Minuten. Die ALDH2-Primer EG534 (GTTCTCTCCGATGACAGGATCAACTGCTAC) und EG536 (CAGACATTAACACACTGGGCATTTAGGTC). Mit EG534-Primern amplifizierte PCR-Fragmente wurden direkt mit EG535 (TACGTTCCCGTGGGCAGAACTGGTGCCTT)51 sequenziert.

Menschliche Daten wurden mit dem Softwarepaket STATA 14.0 (Stata Corp., College Station, Texas, USA) analysiert. Kontinuierliche Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt und durch Student-t-Tests verglichen, sofern nicht anders angegeben. Kategoriale Werte, ausgedrückt als Zahlen und Prozentsätze, wurden je nach Bedarf mit dem Chi-Quadrat-Test oder dem exakten Fisher-Test verglichen. Der Zusammenhang von ALDH2-Polymorphismus (als ALDH2 Vt) mit klinischen VAs wurde mithilfe logistischer Regression bewertet. Wir haben weiter getestet, ob das Vorhandensein von ALDH2 Vt den Zusammenhang zwischen Alkoholkonsum und VAs oder QTc-Verlängerung verändert. Tierdaten wurden ungepaarten Student-t-Tests oder Mann-Whitney-U-Tests unterzogen, um zwischen 4 % EtOH und normal ernährten Mäusen innerhalb derselben Genotypkategorie (Wt oder ALDH2*2 KI) zu vergleichen, basierend auf EKGs, Western Blot, immunkonfokalem, und elektrophysiologische Ex-vivo-Daten (Pfadklemme oder optische Kartierung). Die Analysen wurden mit GraphPad Prism 8 (GraphPad, La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Die statistische Analyse war zweiseitig und die Signifikanz wurde auf p < 0,05 festgelegt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Anfragen zum Zugriff auf den Datensatz von qualifizierten Forschern, die in den Protokollen zur Vertraulichkeit menschlicher Probanden geschult sind, können an den institutionellen Datenzugriffs-/Ethikausschuss des MacKay Memorial Hospital für Forscher gesendet werden (Kontaktinformationen des Institutional Review Board: MacKay Memorial Hospital. Adresse: Nr. 92, Abschnitt 2, Zhongshan N. Rd., Taipei City 10449, Taiwan. TEL: 02-25433535#3486~3488, E-Mail: [email protected]). Die den Abbildungen zugrunde liegenden Quelldaten finden Sie in den Zusatzdaten 1, unbeschnittene Versionen der Blots finden Sie in den Zusatzabbildungen. 11–15. Weitere Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.

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Die Arbeit von C.-H. Chen und D. Mochly-Rosen Die vorliegende Studie wurde vom National Institute of Health, USA, unterstützt und D. Mochly-Rosen erhielt ein Forschungsstipendium AA11147. Diese Studie wurde außerdem vom National Science Council (NSC) unterstützt (101-2314-B-195-020, 103-2314-B-010-005-MY3, 103-2314-B-195-001-MY3, 101- 2314-B-195-020–MY1), Ministerium für Wissenschaft und Technologie (MOST) (103-2314-B-195-006-MY3, 106-2314-B-195-008-MY2, 107-2320-B- 715-002-MY3, 108-2314-B-195-018-MY2, 109-2314-B-715-008, 110-2314-B-715-009-MY1, 110-2320-B-715-002, 111-2314-B-715-013, 111-2628-B-715-001-MY3), MacKay Memorial Hospital (10271, 10248, 10220, 10253, 10375, 10358, E-102003, MMH-108-127, MMH -110-114, MMH-110-03) und MacKay Medical College (MMC-RD-108-1B-33, MMC-RD-108-2B-02, MMC-RD-109-1B-18, MMC-RD- 110-CF-G001-02, MMC-RD-110-1E-P002, MMC-RD-111-1B-P025, MMC-RD-111-CF-G001-02).

Medizinische Fakultät, MacKay Medical College, New Taipei, Taiwan

An-Sheng Lee, Kuo-Tzu Sung, Cheng-Huang Su, Yun-Fang Chen, Wei-Yu Chen, Shih-Wei Wang, Chung-Lieh Hung und Hung-I Yeh

Abteilung für Herz-Kreislauf-Medizin, China Medical University Hospital, Taichung, Taiwan

An-Sheng Lee

Institut für Biomedizintechnik, Hochschule für Elektrotechnik und Informationstechnik, Nationale Yang Ming Chiao Tung Universität, Hsinchu, Taiwan

Yen-Ling Sung & Shien-Fong Lin

Graduierteninstitut für biomedizinische Optomechatronik, Taipei Medical University, Taipei, Taiwan

Yen-Ling Sung

Graduierteninstitut für medizinische Genomik und Proteomik, College of Medicine, National Taiwan University, Taipei, Taiwan

Szu-Hua Pan & Xuan-Ren Chen

Studiengang Genom- und Systembiologie, National Taiwan University und Academia Sinica, Taipeh, Taiwan

Szu-Hua Pan

Doktoratsstudium der Translationalen Medizin, National Taiwan University, Taipei, Taiwan

Szu-Hua Pan

Abteilung für Kardiologie, Abteilungen für Innere Medizin, MacKay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan

Kuo-Tzu Sung, Cheng-Huang Su, Chung-Lieh Hung und Hung-I Yeh

Abteilung für medizinische Forschung, MacKay Memorial Hospital, New Taipei, Taiwan

Shiao-Li Ding, Ying-Jui Lu und Chin-Ling Hsieh

Abteilung für physiologische Untersuchungen, MacKay Memorial Hospital, New Taipei, Taiwan

Chuan-Chuan Liu

Herzrhythmuszentrum und Abteilung für Kardiologie, Abteilung für Medizin, Taipei Veterans General Hospital, Taipei, Taiwan

Fa-Po Chung

Abteilung für Medizin, Nationale Yang Ming Chiao Tung Universität, School of Medicine, Taipei, Taiwan

Fa-Po Chung

Institut für Biomedizinische Wissenschaften, MacKay Medical College, New Taipei, Taiwan

Shih-Wei Wang & Chung-Lieh Hung

Abteilung für Chemie- und Systembiologie, Stanford University, School of Medicine, Stanford, CA, USA

Che-Hong Chen & Daria Mochly-Rosen

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Schreiben – Originalentwurf, ASL; Projektverwaltung, ASL, YJL und CLH (Chin-Ling Hsieh); formale Analyse, YLS und SHP; Datenkuration, KTS und CHS; Validierung, SLD und WYC; Software, YFC und SWW; Supervision, CCL und HIY; Schreiben – Rezension und Bearbeitung, XRC, FPC und CLH (Chung-Lieh Hung); Finanzierungsakquise, CHC, DMR und CLH (Chung-Lieh Hung); Methodik, ASL, YLS und SHP; Konzeptualisierung, CLH (Chung-Lieh Hung) und HIY; Ressourcen, HIY und SFL; Patchklemme, ASL; optische Kartierung, YLS; Immunkonfokale Bildgebung, SHP Alle Autoren haben das endgültige Manuskript gelesen und genehmigt.

Korrespondenz mit Chung-Lieh Hung oder Hung-I Yeh.

Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien des Mackay Memorial Hospital, Taipei, Taiwan, unterstützt. Erklärung konkurrierenden Interesses: CH Chen und D. Mochly-Rosen halten Patente im Zusammenhang mit der ALDA-1-Aktivierung von ALDH2*1 und ALDH2*2. Eines der Patente ist an Foresee Pharmaceuticals lizenziert, ein Unternehmen, bei dem D. Mochly-Rosen als Berater tätig ist. Allerdings beteiligte sich das Unternehmen an keinem der in der Studie enthaltenen Experimente. Die anderen beitragenden Autoren gaben an, dass hinsichtlich der Veröffentlichung dieser Ergebnisse keine Interessenkonflikte bestehen.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteur: George Inglis.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht durch gesetzliche Vorschriften zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Lee, AS., Sung, YL., Pan, SH. et al. Eine häufige ostasiatische Variante der Aldehyddehydrogenase 2*2 fördert ventrikuläre Arrhythmien bei chronischem leichten bis mäßigen Alkoholkonsum bei Mäusen. Commun Biol 6, 610 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04985-x

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Eingegangen: 25. Februar 2022

Angenommen: 26. Mai 2023

Veröffentlicht: 06. Juni 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04985-x

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